細(xì)胞膜氧化濃度相關(guān)蛋白的研究.pdf

1、前言：
　　 細(xì)胞生命活動的延續(xù)需要攝取各種物質(zhì),在這些物質(zhì)的攝取過程中,細(xì)胞膜成了一道不可逾越的屏障。經(jīng)典的跨膜擴(kuò)散理論認(rèn)為,O2,CO2,NH3和H2O這類非極性,小分子物質(zhì)是通過單純擴(kuò)散方式通過細(xì)胞膜的,其轉(zhuǎn)運方向由膜兩側(cè)的濃度差決定,不需要載體或通道蛋白的幫助。然而,有很多現(xiàn)象是單純擴(kuò)散理論無法解釋的,比如細(xì)胞的缺血再灌注損傷。為什么細(xì)胞在氧濃度低的條件下沒有因為缺氧而受損,卻在氧濃度恢復(fù)時受到損傷?
　　 上世

2、紀(jì)80年代末水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)推翻了水分子跨膜轉(zhuǎn)運只能依靠單純擴(kuò)散的理論,這也讓學(xué)者們意識到“氣體分子是通過單純擴(kuò)散進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運的”這一理論也許并不完全正確。人們對氣體分子通道蛋白的尋找開始于對低等生物Mep和Amt轉(zhuǎn)運體家族的研究。Nakhoul等發(fā)現(xiàn)Rh蛋白與Mep/Amt在結(jié)構(gòu)上有大約20%的同源性,這種親緣關(guān)系促使人們在人類紅細(xì)胞中去尋找恒河猴血型(RhesusMacacusbloodgroup,Rh)蛋白的相似功能。有學(xué)者推測,

3、在紅細(xì)胞中Rh蛋白也具有類似的氨轉(zhuǎn)運功能。然而目前并不清楚NH3和NH4+是否是Rh蛋白的特異性轉(zhuǎn)運底物,而Rh蛋白是否為中性氣體分子跨膜轉(zhuǎn)運的非特異性通道也尚無明確結(jié)論。同時人們發(fā)現(xiàn),綠藻中的Rh相似糖蛋白Rh1的表達(dá)是受CO2濃度調(diào)控的,這雖然不能直接說明Rh1蛋白對CO2具有轉(zhuǎn)運功能,但對人類的Rh蛋白可能具有CO2跨膜轉(zhuǎn)運功能做出了推測。近年來有學(xué)者指出,紅細(xì)胞膜上的Rh蛋白可能在碳酸酐酶Ⅱ(carbonicanhydraseⅡ

4、,CAⅡ)附近形成CO2通道,而Rh蛋白位于帶3蛋白周圍,故帶3蛋白復(fù)合體可能同Rh蛋白一起參與了CO2氣體的跨膜轉(zhuǎn)運。近期另有研究發(fā)現(xiàn)Rh相關(guān)糖蛋白(Rhassociatedglycoprotein,RhAG)可能參與CO2轉(zhuǎn)運,通過比較發(fā)現(xiàn)大約50%的CO2轉(zhuǎn)運是由RhAG完成的,而相似的轉(zhuǎn)運量由水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)介導(dǎo)。細(xì)胞膜對CO2的通透性在NH4Cl存在時受到抑制,且呈劑量依賴性,說明CO2和NH4C

5、l可能是通過同一通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運的,并且彼此之間存在競爭性抑制。
　　 在細(xì)胞的生命活動中要消耗大量的氧,以此來提供代謝所需的能量,而細(xì)胞能量代謝過程中所需的氧來源于細(xì)胞外液,因此,當(dāng)細(xì)胞外液氧濃度變化時,細(xì)胞生命活動的能量來源隨之發(fā)生變化,作為生命活動承擔(dān)者的蛋白質(zhì)(尤其是與細(xì)胞外液直接接觸的細(xì)胞膜蛋白)自然也會隨著環(huán)境的不同而發(fā)生變化,使細(xì)胞最大程度地適應(yīng)新的環(huán)境。尤其是當(dāng)細(xì)胞外液的氧濃度降低時,細(xì)胞代謝的能量來源減少,這必然促

6、使細(xì)胞加大對氧的攝取,以保證其正常的生命活動。在此過程中,氧會盡可能多的通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),而細(xì)胞膜蛋白質(zhì)表達(dá)的變化對這一過程的順利完成起到了至關(guān)重要的作用,同時蛋白質(zhì)表達(dá)的改變也使得細(xì)胞的代謝發(fā)生了變化,從而進(jìn)一步適應(yīng)氧濃度變化給細(xì)胞生命活動帶來的改變。
　　 通過我們之前的氧通量實驗研究發(fā)現(xiàn),氣體分子并不像傳統(tǒng)理論解釋的那樣,完全依靠單純擴(kuò)散來進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運,而是還存在載體蛋白參與的易化擴(kuò)散,若能尋找到參與跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)則

7、對解決細(xì)胞生命活動的相關(guān)問題意義重大。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 健康雄性C57小鼠,體重20-25g,均由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。健康成人紅細(xì)胞懸液(B型,RhD陽性;B型,RhD陰性),由遼寧省血液中心提供。RhD陽性、陰性紅細(xì)胞的RhC、c、E、e均為陽性。
　　 2、方法
　　 本實驗采用seglen兩步法灌流肝臟,獲取新鮮離體的小鼠肝臟細(xì)胞,并應(yīng)用自制的氧通量測定裝

8、置,測定并分析不同溶解氧濃度下離體小鼠肝細(xì)胞、人類紅細(xì)胞及不同抑制劑孵育后的人類紅細(xì)胞的跨膜氧轉(zhuǎn)運情況;采用westernblot技術(shù)檢測紅細(xì)胞RhD和AE1在不同氧濃度下的差異表達(dá);應(yīng)用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)檢測肝細(xì)胞膜蛋白在不同氧濃度下的差異表達(dá)。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 用SPSS13.0軟件對氧通量實驗數(shù)據(jù)及westernblot條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,應(yīng)用Imagemaster5.0軟件對樣品蛋白點之間量變變

9、化情況進(jìn)行分析,標(biāo)記出表達(dá)量差異明顯的蛋白點,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗,p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、肝細(xì)胞氧通量實驗中,通過量和氧通量曲線的峰值位于中氧濃度;而通過率和通量率的曲線則是隨初始氧濃度升高而降低的。
　　 2、紅細(xì)胞氧通量實驗中,通過量和氧通量曲線隨初始氧濃度升高而升高,超過中氧濃度后趨于飽和狀態(tài);而通過率和通量率曲線的峰值位于中氧濃度。
　　

10、 3、4,4'-二異硫代硫酸鹽-2,2'-二苯乙烯二磺酸鹽(4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonate,DIDS)孵育后發(fā)現(xiàn)氧通量實驗的各項指標(biāo)均下降,說明陰離子交換蛋白1(anionexchanger1,AE1)可能參與紅細(xì)胞跨膜氧轉(zhuǎn)運,且DIDS的抑制位點可能就是氧的轉(zhuǎn)運位點。
　　 4、RhD陰性紅細(xì)胞氧通量實驗的各項指標(biāo)均低于RhD陽性紅細(xì)胞,說明RhD蛋白可能參與紅細(xì)胞跨膜

11、氧轉(zhuǎn)運。
　　 5、低氧濃度下表達(dá)量大于高氧濃度的肝細(xì)胞膜蛋白質(zhì)可能包括:載脂蛋白E前體,NADH-細(xì)胞色素B5還原酶,溴結(jié)構(gòu)域包含蛋白8,核被膜蛋白2,過氧化物酶體膜蛋白11C,血清白蛋白前體,鋅指蛋白亞型2,波形蛋白,氨基甲酰磷酸合成酶,血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體,磷酸丙糖異構(gòu)酶,腺苷酸激酶同工酶4以及一個未命名的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 1、肝細(xì)胞和紅細(xì)胞的跨膜氧轉(zhuǎn)運可能是膜蛋白參與的易化擴(kuò)散。
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