心肌祖細胞株的建立及篩選鑒定.pdf

1、第一部分啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建和功能鑒定。 目的：重組構(gòu)建攜帶有啟動子基因α-MyHC和報告基因熒光素酶的質(zhì)粒。 方法：（1）PCR擴增α-MyHC第四個外顯子上游5.5kb的片段，并將片段克隆入啟動子質(zhì)粒載體pBGLuc，通過菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定對陽性克隆進行鑒定，得到重組啟動子質(zhì)粒MyHC-GLuc。（2）通過含2％HS的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑Dex檢測質(zhì)粒的有效性和特異性。 結(jié)果：（1

2、）啟動子質(zhì)粒MyHC-GLuc可以有效地在肌細胞分化過程中激活；（2）進一步研究證實，在肌肉細胞分化過程中僅有質(zhì)粒MyHC-GLuc被激活，而對照質(zhì)粒TOP-Luc未被激活；（3）Dex可以有效的誘導(dǎo)MyHC-GLuc的表達，且與形態(tài)變化相一致。 結(jié)論：啟動子質(zhì)粒MyHC-GLuc具有肌肉特異性，且其活性在肌細胞分化過程中能夠被有效激活，因此，它可以方便快捷的應(yīng)用于肌肉細胞分化的研究中。 第二部分 RAR和RXR信號途徑

3、激活促進肌細胞的分化。 目的：RAR和RXR信號途徑激活在C2C12成肌過程中的作用。 方法：（1）ATRA和9cisRA分別以最適劑量刺激C2C12，以Dex為對照，分別通過報告基因的測定，PCR，WB和IF來檢測肌肉細胞相關(guān)基因和蛋白的表達變化情況；通過組織學(xué)染色觀察細胞形態(tài)變化；通過電鏡檢測細胞的結(jié)構(gòu)分化情況；（2）構(gòu)建和制備攜帶有人RA受體RARα和RXRα的腺病毒Ad-RARα和Ad-RXRα（3）通過Ad-R

4、ARα和Ad-RXRα直接感染C2C12，檢測細胞分化情況；（4）C2C12感染Ad-RARα和Ad-RXRα后，移植到裸鼠股四頭肌，兩周后處死動物，取出標本切片，研究過表達RARα和RXRα的C2C12在體內(nèi)分化情況。 結(jié)果：（1）1μMATRA和5μM9CRA相對于1μMDex，能夠更有效的促進成肌過程，肌細胞晚期基因PAX3和TnT表達明顯較高，且細胞形態(tài)有明顯變化，由原來的長梭型逐漸演變?yōu)殚L棒狀，細胞體積明顯增大，且細胞

5、之間有融合，電鏡下可見明顯的粗細肌絲結(jié)構(gòu)；（2）Ad-RARα和Ad-RXRα能夠有效感染C2C12，并可檢測出感染后C2C12表達RARα和RXRα量明顯增高；（3）Ad-RARα和Ad-RXRα感染C2C12后，C2C12表達肌細胞的早期標志基因明顯降低，但是晚期基因明顯增高；（4）C2C12感染Ad-RARα和Ad-RXRα移植到體內(nèi)后，未形成明顯包塊，移植細胞沿肌梭走向分布，存活較好，但是排列沒有成熟肌組織規(guī)則，且分化程度不高。

6、 結(jié)論：RAR和RXR信號途徑可促進C2C12成肌進程。第三部分心肌祖細胞株的建立及篩選鑒定。 目的：建立穩(wěn)定來源于心臟的心肌祖細胞株，為研究影響心肌祖細胞在成體心肌細胞受損的情況下增殖分化的因素提供理想的細胞模型。 方法：（1）分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細胞；（2）通過感染逆轉(zhuǎn)錄病毒SSR69而使心肌細胞永生化，通過抗生素篩選和無限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細胞；（3）根據(jù)心肌細胞發(fā)育過程中基因表達變

7、化，篩選出具有心肌祖細胞特性的單克隆細胞株；（4）篩選出的5個心肌祖細胞單克隆，在Dex的誘導(dǎo)下，檢測報告基因和心肌細胞早晚期基因表達變化情況，衡量其分化能力。 結(jié)果：（1）成功分離培養(yǎng)出心肌細胞，部分細胞可見明顯搏動；（2）感染病毒后，通過潮霉素篩成功選出76個單克隆，并將其進行命名為CP15-＃；（3）對第1～20號克隆，根據(jù)心肌細胞發(fā)育過程中早中晚期的基因表情況篩選出5個具有心肌祖細胞特性的克隆CP15-5a，CP15-9