基于CHO DG44細胞的穩(wěn)定高產(chǎn)細胞株篩選系統(tǒng)的初步建立.pdf

1、目前單克隆抗體(mAbs)已經(jīng)成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產(chǎn)品。能夠大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體的一個重要前提是獲得穩(wěn)定高產(chǎn)細胞株，然而篩選持續(xù)穩(wěn)定表達外源蛋白的重組細胞株是費時費力的過程。研究者需要不斷優(yōu)化表達載體和細胞株篩選方式。本實驗室已研制出的流感病毒、肝炎病毒中和抗體需要大量的抗體用于臨床前研究，因此需要建立一個高產(chǎn)、穩(wěn)定的細胞株表達平臺。本研究以乙肝嵌合抗體E6F6cAb為模式蛋白，以CHO DG44(dhfr-)作為宿主細胞，構(gòu)建

2、嵌合抗體E6F6cAb穩(wěn)定高產(chǎn)細胞株，從而建立起穩(wěn)定細胞株篩選系統(tǒng)，包括質(zhì)粒構(gòu)建、潮霉素加壓篩選、MTX加壓誘導(dǎo)基因擴增、細胞克隆化（單克隆有限稀釋法、流式分選法）、細胞株產(chǎn)能評價和穩(wěn)定性評估、哺乳動物細胞的穩(wěn)定表達工藝等環(huán)節(jié)。高產(chǎn)細胞株的獲得，使得單克隆抗體的大量表達成為可能，為以后的抗體藥物表達奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以CHO DG44(dhfr-)為宿主細胞系，共轉(zhuǎn)染優(yōu)化后的質(zhì)粒pCWLK和pCH，利用質(zhì)粒中潮霉素抗性進

3、行首次篩選并將存活細胞克隆化，獲得初始細胞株。為了進一步提高細胞株產(chǎn)量，我們挑選6個表達抗體最高的初始細胞株，分別用MTX進行加壓，使抗體基因擴增。初始細胞株(1-48，1-63)經(jīng)幾輪MTX加壓篩選后，抗體產(chǎn)量均有明顯的提高。接下來將這2個初始細胞株經(jīng)MTX篩選得到的細胞群體單克隆化，并對其中20個單克隆細胞株進行表達水平鑒定，結(jié)果表明抗體表達量最高為43mg/L。我們挑選4個表達量較高的細胞株進行長期培養(yǎng)和穩(wěn)定性研究。經(jīng)過60天的長

4、期培養(yǎng)及產(chǎn)量檢測我們確定這4個單克隆細胞株均能長期穩(wěn)定表達E6F6cAb抗體。
　　 為了進一步提高高產(chǎn)細胞株篩選的效率，本研究還對單克隆篩選方法進行改進，嘗試采用流式分選和有限稀釋法相結(jié)合的方法篩選細胞株。從經(jīng)MTX加壓后的1-63細胞群體得到256個單克隆細胞株，細胞單產(chǎn)量為5-25 pg/c/d,細胞株抗體表達量最高達到140mg/L。
　　 為了提高抗體的產(chǎn)量，本研究以單克隆細胞株1-63-10G11(43mg/

5、L)為模式細胞株，摸索細胞株穩(wěn)定表達工藝的初步優(yōu)化。從實驗室原有培養(yǎng)基庫中篩選得到培養(yǎng)基DG44-32，并以其脫鹽濃縮液作為補料培養(yǎng)基，進行細胞株的流加培養(yǎng)。同時以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對基礎(chǔ)與補料培養(yǎng)基中氨基酸Asn、Asp、Glu與Gln濃度分別進行調(diào)整，使批培養(yǎng)最大活細胞密度達到5×106個/ml，流加培養(yǎng)達到7～8×106個/ml。將最終優(yōu)化的培養(yǎng)基放大到生物反應(yīng)器中，細胞生長情況和抗體表達產(chǎn)量與搖瓶中一致。該研究為進一步動物細胞規(guī)模