過(guò)表達(dá)人TIGAR的CHO細(xì)胞株構(gòu)建及其抗凋亡機(jī)制研究.pdf

1、【目的】細(xì)胞凋亡（apoptosis）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)抗體藥物過(guò)程中限制活細(xì)胞密度提高的關(guān)鍵因素之一，進(jìn)而制約了抗體藥物的產(chǎn)量。本課題采用基因工程手段在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary, CHO）中過(guò)表達(dá)一種新型凋亡調(diào)控基因TIGAR（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator），分析該CHO-TIGAR細(xì)胞株在批次培養(yǎng)中的生長(zhǎng)代謝、抑制凋

2、亡等現(xiàn)象，探究TIGAR基因在CHO細(xì)胞中抑制凋亡的主要機(jī)制，進(jìn)而闡述該研究相關(guān)應(yīng)用價(jià)值及意義。
　　【方法】第一部分構(gòu)建過(guò)表達(dá)人TIGAR的CHO細(xì)胞株的主要方法有：①設(shè)計(jì)特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到hTIGAR基因，構(gòu)建pcDNA3.0-TIGAR真核表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染CHO-SP細(xì)胞并挑選陽(yáng)性克隆，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。利用Real-time PCR檢測(cè)TIGAR基因mRNA水平表達(dá)。②在500 m

3、L搖瓶中進(jìn)行批次培養(yǎng)，獲取CHO-TIGAR細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞CHO-pcDNA3.0的生長(zhǎng)曲線(xiàn)、活率、葡萄糖消耗量等參數(shù)。
　　本課題的第二部分著重探討TIGAR基因在CHO細(xì)胞中抑制凋亡的主要機(jī)制，其主要方法有：①批次培養(yǎng)中通過(guò)Annexin V/PI法檢測(cè)CHO-TIGAR細(xì)胞和對(duì)照組在第4-7天的凋亡率；利用DCFH-DA染料檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在批次培養(yǎng)中每天的活性氧族（reactive oxygen species, RO

4、S）水平。②Western blot法檢測(cè)CHO-TIGAR細(xì)胞和 CHO-pcDNA3.0細(xì)胞在批次培養(yǎng)第5-8天中 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7等的表達(dá)情況，比較兩株細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的差異。
　　【結(jié)果】在批次培養(yǎng)中，CHO-TIGAR細(xì)胞株的最高細(xì)胞密度出現(xiàn)在第四天，達(dá)到7.2×106 cells/mL，對(duì)照組的最高密度出現(xiàn)在同一時(shí)間，只有6.5×106 cells/mL；細(xì)胞活率、

5、培養(yǎng)天數(shù)方面，CHO-TIGAR細(xì)胞均優(yōu)于對(duì)照細(xì)胞株；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在批次培養(yǎng)的第6、7、8天凋亡率分別為5.5%、6.08%和21.92%，在對(duì)照組中相對(duì)應(yīng)的為10.4%、20.28%、50.3%；檢測(cè)批次培養(yǎng)1-5天細(xì)胞內(nèi)ROS水平，CHO-TIGAR細(xì)胞均低于對(duì)照組；Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)照組中與凋亡發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)Caspase-9、Caspase-3/7表達(dá)水平均高于CHO-TIGAR細(xì)胞