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文檔簡(jiǎn)介
1、目的：制備小鼠 OC-STAMP多克隆抗體，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)小鼠OC-STAMP的RAW264.7細(xì)胞株，研究糖尿病狀態(tài)下OC-STAMP對(duì)巨噬細(xì)胞功能、狀態(tài)的影響及其可能機(jī)制。
方法：通過(guò)向小鼠腹腔內(nèi)注射無(wú)抗生素、無(wú)血清 RPMI1640細(xì)胞培液的方法獲取小鼠的腹腔靜置巨噬細(xì)胞，TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出可表達(dá)小鼠OC-STAMP羧基端180個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列，原核表達(dá)獲得融合
2、蛋白。融合蛋白以親和層析法純化后與佐劑充分混合，皮下多點(diǎn)注射免疫健康新西蘭大白兔。采用間接ELISA法測(cè)定免疫所獲得的兔抗小鼠OC-STAMP多克隆抗體效價(jià)，Western Blot法檢測(cè)抗體特異性。運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增小鼠OC-STAMP基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，將目的基因克隆到慢病毒過(guò)表達(dá)載體中構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒。在工具細(xì)胞293T中包裝慢病毒，收集、濃縮病毒后感染目的細(xì)胞RAW264.7，以嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定過(guò)表達(dá)小鼠OC-STAMP的R
3、AW264.7細(xì)胞株。
結(jié)果：構(gòu)建pGEX-4T-1/OC-STAMP重組質(zhì)粒，以原核表達(dá)所得融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得的兔抗小鼠 OC-STAMP多克隆抗體效價(jià)高、特異性好。構(gòu)建包含小鼠OC-STAMP編碼區(qū)全長(zhǎng)的過(guò)表達(dá)慢病毒重組載體，并成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)小鼠OC-STAMP的RAW264.7細(xì)胞株。
結(jié)論：以小鼠OC-STAMP羧基端180個(gè)氨基酸殘基為抗原，免疫獲得兔抗小鼠OC-STAMP多克隆抗體
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