dcf1條件剔除（雜合子）小鼠構(gòu)建及DCF1多克隆抗體制備.pdf

1、隨著神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在胚胎和成年神經(jīng)組織中的發(fā)現(xiàn)，以及對(duì)NSCs生物學(xué)特性和分化研究的不斷深入，NSCs被視為對(duì)神經(jīng)損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療的一個(gè)有效方法。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元多為分化終末細(xì)胞，其自我修復(fù)和替代功能基本消失。盡管成體腦內(nèi)也有NSCs存在，但由于環(huán)境因素，形成新神經(jīng)元能力較弱，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子缺失而發(fā)生功能障礙。NSCs的潛在分化能力和較強(qiáng)的增殖、遷移能力使它成為一個(gè)良好的細(xì)胞移植源。通過體外移植和體

2、內(nèi)激活NSCs來改變細(xì)胞生存環(huán)境，使NSCs定向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，重建神經(jīng)環(huán)路和恢復(fù)其功能，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟新途徑。而闡明神經(jīng)干細(xì)胞的分化機(jī)制對(duì)于解決以上問題有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。 在神經(jīng)干細(xì)胞中，樹突細(xì)胞因子(dentritic cell-derived factor 1，DCF1)基因的功能未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)dcf1基因在未分化的神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)，而在終末分化的神經(jīng)細(xì)胞中低表達(dá)；隨后在小鼠神經(jīng)

3、干細(xì)胞中過量表達(dá)該基因，通過與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)dcf1基因的細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)被抑制，dcf1基因可維持神經(jīng)干細(xì)胞的狀態(tài)。而用RNAi沉默該基因后，能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。這些工作都表明dcf1基因可能與神經(jīng)干細(xì)胞的分化有關(guān)。 本課題主要進(jìn)行以下兩部分的研究： 1：利用條件性基因打靶技術(shù)，構(gòu)建dcf1條件剔除小鼠模型。成功構(gòu)建dcf1條件剔除載體，篩選到發(fā)生正確同源重組的ES細(xì)胞，得到由ES細(xì)胞發(fā)育而成的嵌合體，PCR

4、技術(shù)鑒定出由嵌合體回交后出生的dcf1條件剔除雜合子。 2：為了驗(yàn)證后期的基因剔除小鼠和研究DCF1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，通過原核表達(dá)系統(tǒng)，制備DCF1多克隆抗體。構(gòu)建原核表達(dá)載體，發(fā)酵DCF1原核蛋白，DCF1蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔，獲得DCF1多克隆抗體，利用DCF1抗體證明神經(jīng)干細(xì)胞和分化的神經(jīng)細(xì)胞都表達(dá)dcf1基因，但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中不表達(dá)。冰凍組織切片和Westem Blot證明腦組織中確實(shí)存在DCF1蛋白，并且DCF1免