鵝催乳素受體基因克隆和多克隆抗體制備及組織表達分析.pdf

1、催乳素受體(Prolactin receptor，PRLR)是單次跨膜的受體蛋白，催乳素通過它在脊椎動物中起著廣泛的生理作用。為理解鵝PRLR的生理作用，我們應用RACE(Rapidamplification of cDNA ends)技術克隆了全長為3，159bp的鵝催乳素受體基因(Prolactinreceptor gene，PRLR)cDNA并制備了PRLR兔抗鵝多克隆抗體，對洪澤湖鵝成體組織中mRNA及蛋白表達進行了分析。同時，

2、對洪澤湖鵝PRLR5’-UTR內存在的一個SNP位點進行了驗證。
　　 1.鵝催乳素受體基因克隆及基因組織表達
　　 克隆的鵝PRLR cDNA全長3，159bp，含443bp5’-UTR、2，496bp編碼區(qū)和220bp3’-UTR，編碼14個或以上外顯子。預測鵝PRLR含831個氨基酸(Amino acid，aa)，與雞、鴿及火雞PRLR同源性分別為87.7，85.2和84.8％，N-末端含一個24aa信號肽，胞外域

3、含兩個配體結合區(qū)。每個配體結合區(qū)內含二對半胱氨酸殘基和一個WSEWS五肽WS基序。進化分析表明，鵝PRLR在進化中高度保守?？寺〉腸DNA序列比對表明，成年公鵝睪丸至少同時表達五種PRLR轉錄本。其中一種轉錄本由另一種轉錄本缺失第1外顯子后95bp形成；第三種轉錄本由不同于以上二種轉錄本的另一啟動子選擇不同的轉錄起始點起動轉錄，產生一個新的第1外顯子，并直接剪接到第3外顯子而形成；第四種轉錄本缺失133bp的外顯子4a而不編碼或可能編碼

4、一種截短的PRLR蛋白異形體；第五種轉錄本是一種轉錄本異形體，編碼的蛋白異形體類似于非禽類其它脊椎動物PRLR，即胞外域只含有一個配體結合區(qū)。RT-PCR結果表明，鵝PRLR mRNA在成年鵝睪丸，輸精管、卵巢、輸卵管、腎、大腸、小腸、脾組織中均有表達，其中以腎、睪丸、大腸及小腸中表達最為豐富。
　　 2.鵝催乳素受體多克隆抗體制備及受體組織表達
　　 構建的exPRLR-pET-28a(+)轉化宿主菌E.coli Ro

5、ster后，建立了可誘導的原核表達系統(tǒng)。在25℃培養(yǎng)、IPTG誘導條件下，表達催乳素受體胞外域重組蛋白exPRLR。超聲波裂解菌液上清及包涵體中的exPRLR使用Ni親和層吸柱純化，并用純化、復性的exPRLR免疫新西蘭白兔，制備兔抗鵝exPRLR抗血清，硫酸銨沉淀抗血清獲得多克隆抗體。然后多克隆抗體用原核表達的鵝PRLR胞外域重組蛋白及鵝組織表達的PRLR加以驗證。同時，組織表達分析表明，成年母鵝組織中至少存在三種PRIR蛋白，它們或

6、許是經典的PRLR蛋白及PRLR的蛋白異形體。
　　 3.鵝催乳素受體基因單核酸多態(tài)性及微量動物細胞基因組DNA提取液
　　 克隆的cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)2個錯配位點。位于編碼區(qū)內的錯配位點推測可能是一種沉默SNP，不改變蛋白序列；位于5’-UTR的錯配位點在洪澤湖核心群內被證明是一個SNP。同時，結合鵝微量羽髓細胞基因組DNA提取，我們研發(fā)了一種微量動物細胞基因組DNA提取液及相應的提取方法。此方法實現(xiàn)了動物細胞基因組D