SD大鼠新基因PMP22CD的表達(dá)分析及其多克隆抗體制備.pdf

1、目的：SD大鼠PMP22CD是通過電子克隆的方法獲得的一新基因，NCBI基因登錄號AY-634367，已成功克隆了此基因，其功能尚未被研究，擬對其功能進(jìn)行初步探索。 方法：首先通過生物信息學(xué)分析了解PMP22CD基因和編碼蛋白質(zhì)的基本信息；構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒PET-32a(+)/PMP22CD，在大腸桿菌BL21(DE3 Lysis)中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，應(yīng)用純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備PMP22CD多克隆抗體；其次應(yīng)用

2、RT-PCR技術(shù)研究其在組織中的空間和時(shí)間表達(dá)譜，同時(shí)應(yīng)用組織原位雜交和免疫組化方法分別在mRNA水平和蛋白水平研究PMP22CD在睪丸組織細(xì)胞中的表達(dá)情況：最后通過構(gòu)建PEGFP-C1/PMP22CD野生型和突變型重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48h后，激光共聚焦觀察熒光分布，研究PMP22CD亞細(xì)胞定位和N-端信號錨定序列對PMP22CD蛋白定位的影響。 結(jié)果：PMP22CD具有四個外顯子，ORF為696bp，定位于染色體8q2

3、2，編碼的蛋白含有231個氨基酸殘基，具有四次跨膜螺旋，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，C-端具有磷酸化位點(diǎn)，與家族中其他成員的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒PET-32a(+)/PMP22CD，在大腸桿菌BL21(DE3 Lysis)中獲得表達(dá)，融合蛋白主要以包涵體的形式存在，采用電洗脫的方法純化融合蛋白后免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，瓊脂糖雙向擴(kuò)散試驗(yàn)和Westem Blot顯示抗體具有一定的效價(jià)和特異性。表達(dá)譜顯示PMP22CD特異性得

4、表達(dá)于13月齡以后的睪丸組織。原位雜交與免疫組化結(jié)果顯示PMP22CD主要表達(dá)于14月齡大鼠睪丸組織各級精母細(xì)胞，在成熟的精子細(xì)胞未見其表達(dá)，顯示出生殖細(xì)胞表達(dá)時(shí)空特異性。野生型PEGFP-C1/PMP22CD表達(dá)的HeLa細(xì)胞，熒光主要聚集于細(xì)胞核周圍，呈顆粒狀分布，突變型PEGFP-C1/PMP22CD表達(dá)的HeLa細(xì)胞，熒光彌漫性的分布于整個細(xì)胞漿中，顆粒狀的分布形式消失。 結(jié)論：PMP22CD特異性的表達(dá)于13月齡以后的