小鼠、大鼠、豬DHRS4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及小鼠DHRS4多克隆抗體的制備.pdf

1、目的:輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR)是全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)代謝生成途徑中的一種關(guān)鍵酶。atRA在體內(nèi)是由維生素A(Vitamin A)即視黃醇(Retinol)經(jīng)過兩步代謝生成,中間的代謝產(chǎn)物為視黃醛(Retinal),輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶在從Retinol到Ret

2、inal這一步中起著關(guān)鍵作用。
　　NRDR基因位于人的14q11.2,包含三個拷貝,分別命名為DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1,但在其他哺乳動物體內(nèi)多只存在DHRS4一個單拷貝,如大鼠、小鼠、豬、牛、馬、狗等。在另外一些動物中只存在有兩個拷貝,其分別為DHRS4和DHRS4L1,如黑猩猩、類人猿。對于人體內(nèi)NRDR的研究發(fā)現(xiàn)其存在比較復(fù)雜的調(diào)控表達(dá)方式,通過小鼠這樣的只有DHRS4一個單拷貝的動物作為一個模型進(jìn)行研究能

3、幫助我們進(jìn)一步探尋人體內(nèi)NRDR調(diào)控表達(dá),因此,DHRS4原核表達(dá)載體的構(gòu)建及小鼠多克隆抗體為本課題組以小鼠作為模型進(jìn)行研究提供了幫助。
　　對于輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶在生物體內(nèi)所發(fā)揮的作用及其酶活性,本課題組已對兔子體內(nèi)該酶所發(fā)揮的作用做了深入的研究,發(fā)現(xiàn)這種酶不僅具有很高的催化視黃醇、視黃醛之間氧化還原的活性,而且對其他類似視黃醇、視黃醛的醛酮類物質(zhì)存在氧化還原活性。對于其他動物體內(nèi)該酶的活性,近年來有文章發(fā)現(xiàn)各種動物

4、體內(nèi)該酶的作用存在差異,特別是在人體內(nèi)該酶的作用,目前尚少有報道。因此,有必要深入研究其所起的生理功能及其差異。但是,該酶在體內(nèi)含量低,分離純化困難。通過體外表達(dá)可以得到大量重組酶,從而為DHRS4基因表達(dá)調(diào)控及功能研究提供實驗原料。
　　方法:應(yīng)用RT-PCR從大鼠、小鼠、豬肝組織擴(kuò)增DHRS4的開放閱讀框序列,測序確認(rèn)后將其編碼區(qū)構(gòu)建到載體pDONRTM201上,再通過LR反應(yīng)再將其置換到表達(dá)載體pDESTTM17上,測序確認(rèn)

5、后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21-AI工程菌中,并經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)出DHRS4融合蛋白。以小鼠融合蛋白作為免疫原免疫大白兔,制備小鼠DHRS4多克隆抗體。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建大鼠、小鼠、豬DHRS4重組質(zhì)粒;轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的E.coli BL21-AI經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)4h后高效表達(dá)DHRS4融合蛋白;Western bolt實驗結(jié)果顯示制備的多克隆抗體可特異性檢測小鼠肝組織DHRS4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建大鼠、小鼠、豬