GANT61對(duì)髓母細(xì)胞株DAOY的誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma，MB)是一種比較常見的兒童中樞性的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，多在兒童患者3-7歲之間發(fā)病，也可累及部分成年患者。臨床表現(xiàn)多為顱高壓癥狀，共濟(jì)失調(diào)體征以及腦積水等情況，嚴(yán)重?fù)p害著患者的生命健康。目前的治療手段主要以手術(shù)為主，放化療為輔，但是療效并不滿意。因此，研究MB發(fā)病的分子機(jī)制，尋找用于治療分子機(jī)制靶點(diǎn)的藥物有著重大意義。多數(shù)臨床及實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，MB的產(chǎn)生和發(fā)展與Sonic Hedgehog(S

2、HH)信號(hào)通路的異?；罨兄芮新?lián)系。GANT61是SHH信號(hào)通路Gli1靶點(diǎn)的特異性抑制劑，它通過抑制SHH下游通路中Gli1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，阻斷SHH信號(hào)通路，達(dá)到促進(jìn)MB細(xì)胞凋亡的作用。然而，關(guān)于GANT61是通過哪些凋亡機(jī)制促使MB細(xì)胞凋亡以及它與凋亡相關(guān)蛋白關(guān)系的研究并不多。因此，本研究擬通過GANT61對(duì)人髓母細(xì)胞株Daoy的誘導(dǎo)凋亡作用來觀察GANT61與Gli1以及它與Bcl-2、Caspase9和Casepase3的關(guān)系，

3、探討GANT61促使MB細(xì)胞凋亡可能通過的凋亡途徑，為闡明Sonic Hedgehog通路中Gli1靶點(diǎn)表達(dá)與MB細(xì)胞凋亡的聯(lián)系提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:培養(yǎng)人髓母細(xì)胞株Daoy細(xì)胞，經(jīng)過GANT61處理分為4組，即空白對(duì)照組、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L藥物組。采用細(xì)胞增殖法檢測(cè)Daoy細(xì)胞在GANT61作用下的增殖數(shù)、增殖率以及形態(tài)的變化;用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)染色流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定G

4、ANT61誘導(dǎo)Daoy細(xì)胞凋亡的影響;用細(xì)胞侵蝕及遷移法檢測(cè)GANT61對(duì)Daoy細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響;用qPCR法檢測(cè)GANT61對(duì)Daoy細(xì)胞中Gli1和Bcl-2的基因表達(dá)量的差異;用Western blot法檢測(cè)Daoy細(xì)胞中Gli1、Bcl-2、Caspase9和Casepase3的蛋白表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果:(1)細(xì)胞增殖法顯示:Daoy細(xì)胞在GANT61作用后，細(xì)胞增殖數(shù)明顯減少，細(xì)胞間隙增大，異常突起增多;隨著G

5、ANT61濃度持續(xù)升高，Daoy細(xì)胞的增殖數(shù)及增殖率明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P＜0.05)，并且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　(2) AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)顯示:Daoy細(xì)胞在經(jīng)過4組GANT61作用24H后，細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.05)。
　　(3)細(xì)胞侵蝕及遷移法檢測(cè)顯示:Daoy細(xì)胞在經(jīng)過濃度分別為0、10、20、40μmol/L的GANT61作用24H后

6、，Daoy細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力受到了明顯抑制(P＜0.05)，并且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　(4) qPCR法結(jié)果顯示:通過比較GANT61組和對(duì)照組，Daoy細(xì)胞的Gli1和Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯下降(P＜0.05);提示GANT61能夠抑制Gli1基因表達(dá)，繼而下調(diào)下游Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　(5) Western blot法結(jié)果顯示:GANT61組較對(duì)照組Gli1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明

7、顯下降(P＜0.05);Caspase9和Caspase3蛋白表達(dá)水平明顯上升(P＜0.05)，說明GANT61抑制Gli1蛋白的表達(dá)，下調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，可能通過線粒體凋亡途徑活化Caspase9和Caspase3蛋白，上調(diào)兩種Caspase蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示GANT61對(duì)四種蛋白的表達(dá)調(diào)控具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論:GANT61能夠明顯地抑制MB細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，促進(jìn)MB細(xì)胞凋亡。并且GANT61能通過抑制Gli1的表