過(guò)表達(dá)人LDH-C的CHO細(xì)胞株構(gòu)建及其對(duì)乳酸代謝和細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、重組蛋白藥物因?yàn)槠渚哂懈呋钚?、特異性?qiáng)、低毒性、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點(diǎn),已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分,現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于治療各種疾病包括自身免疫性疾病、腫瘤等。但是生產(chǎn)能力不足已經(jīng)成為重組藥物發(fā)展的瓶頸,為滿足不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需要,重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的增加不僅僅通過(guò)擴(kuò)大反應(yīng)器的體積來(lái)實(shí)現(xiàn),更重要的是通過(guò)細(xì)胞工程技術(shù)改造獲得一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng),產(chǎn)量高,代謝廢物少、抗凋亡的細(xì)胞株。在CHO細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中,特別是在分批培養(yǎng)過(guò)程的后期,乳

2、酸積累是限制細(xì)胞密度的重要原因之一,乳酸還會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降,而在生物反應(yīng)器中為調(diào)整pH值添加堿性物質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致滲透壓升高,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響,最終導(dǎo)致細(xì)胞活率以及蛋白產(chǎn)量的降低。LDH-C基因存在于精子細(xì)胞、睪丸細(xì)胞和某些腫瘤中,作為乳酸脫氫酶(LDH)的一個(gè)亞型,同乳酸脫氫酶A和B相比,LDH-C更偏向于利用乳酸作為底物,催化乳酸向丙酮酸方向發(fā)生反應(yīng)。LDH-C有助于精子在高乳酸的環(huán)境中生存,同時(shí)它允許乳酸作為細(xì)胞能量的

3、來(lái)源。雖然LDH-C在CHO細(xì)胞中的作用目前還不清楚,但是LDH-C可以作為細(xì)胞工程上的一個(gè)有趣的靶點(diǎn),它可能會(huì)使CHO細(xì)胞代謝向有氧乳酸代謝方向轉(zhuǎn)變,改善細(xì)胞生長(zhǎng)的高乳酸環(huán)境。因此我們猜想在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LDH-C基因可能會(huì)對(duì)改善細(xì)胞培養(yǎng)的高乳酸環(huán)境從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究旨在通過(guò)在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)人LDH-C基因,改善細(xì)胞培養(yǎng)后期的高乳酸環(huán)境,從而減少高乳酸引起的細(xì)胞凋亡。本研究的意義在于為減少代謝副產(chǎn)物乳酸提供新的途徑,為提

4、高抗體或重組蛋白類藥物的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。
　　目的：在工程細(xì)胞CHO中過(guò)表達(dá)乳酸脫氫酶(LDH-C)基因,旨在利用基因工程手段構(gòu)建出培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、代謝副產(chǎn)物少、抗凋亡的細(xì)胞株,為抗體產(chǎn)量的增加奠定基礎(chǔ)。
　　方法：運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從人SKBR-3細(xì)胞中擴(kuò)增出LDH-C基因,經(jīng)雙酶切(XhoⅠ和HindⅢ)后與真核表達(dá)載體pcDNA3.0相連接,利用Lipo2000轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)

5、定表達(dá)LDH-C的單克隆細(xì)胞株。經(jīng)Real-time PCR檢測(cè)LDH-C基因在mRNA水平的表達(dá)量,挑選出三株表達(dá)量比較高的細(xì)胞株進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng),通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 CHO/LDH-C和對(duì)照組細(xì)胞CHO/pcDNA3.0的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞活率以及IVCC曲線等參數(shù),獲得一株IVCC值最高的細(xì)胞。在三種不同的分批補(bǔ)料培養(yǎng)條件下,觀察LDH-C對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,每天記錄細(xì)胞生長(zhǎng)的密度,并用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞的活率,同時(shí)每天檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上

6、清中代謝產(chǎn)物乳酸的含量,以研究LDH-C對(duì)CHO代謝的影響。對(duì)CHO/LDH-C進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)、Annexin V與PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、JC-1染色檢測(cè)兩組細(xì)胞的線粒體膜電位以及western-blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路中的相關(guān)蛋白表達(dá),以研究LDH-C對(duì)凋亡的影響。
　　結(jié)果：⑴成功克隆人LDH-C基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0/LDH-C,并成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO/LDH-C細(xì)胞株。通過(guò)Real-timePCR鑒

7、定、流加培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線以及酶活鑒定等實(shí)驗(yàn)獲得一株LDH-C表達(dá)量較高,生長(zhǎng)密度較高的6號(hào)克隆CHO/LDH-C＃6作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。同時(shí),選取CHO/pcDNA3.0＃4作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。⑵在初始培養(yǎng)條件下,兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯差別,但是在第三天分別加入40mM丙酮酸鈉或者40mM乳酸鈉后,對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了抑制,而轉(zhuǎn)染了LDH-C的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)密度顯著高于對(duì)照組細(xì)胞,并且在這兩種培養(yǎng)條件下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的乳酸濃度明顯低于對(duì)照組,

8、特別是在流加培養(yǎng)的后期,LDH-C的作用更加顯著,可以顯著性降低乳酸濃度。⑶利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的CHO/LDH-C細(xì)胞S期增加,說(shuō)明處于DNA復(fù)制期的細(xì)胞增多,增殖活性增加。流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡、western-blot以及線粒體膜電位檢測(cè)均顯示CHO/LDH-C細(xì)胞細(xì)胞凋亡降低,說(shuō)明過(guò)表達(dá)LDH-C通過(guò)可以抑制CHO細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：本課題成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人LDH-C基因的CHO/LDH-C細(xì)胞,并在補(bǔ)