人部分細(xì)胞株中neuritin表達(dá)檢測(cè)及其過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響.pdf

1、目的：(1)檢測(cè)neuritin在人類部分細(xì)胞株中的表達(dá)情況，篩選neuritin高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株；(2)探討neuritin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響。 方法：(1)分別采用RT-PCR與免疫組織化學(xué)技術(shù)在mRNA水平及蛋白水平，檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存11種人類正常和腫瘤細(xì)胞株中neuritin的表達(dá)情況；(2) 擴(kuò)增neuritin ORF，克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1myc/his(-)A中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序鑒定后

2、，抽提并獲取高純度的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)A-neuritin，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染neuritin低表達(dá)細(xì)胞株，RT-PCR及westem-blot鑒定轉(zhuǎn)染效果后，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)neuritin的細(xì)胞；(3)通過MTT比色和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析neuritin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)探討neuritin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。 結(jié)果：(1)通過RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)

3、，篩選出neuritin高表達(dá)細(xì)胞株293T、hUVEC、hUASMC、Soas-2、LOVO、L-02及低表達(dá)細(xì)胞株BMSCs、Hela、ECV-304、SK、QGY；(2)構(gòu)建了neuritin的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)A-neuritin，經(jīng)BamH Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定證實(shí)neuritin基因已正確插入多克隆位點(diǎn)；(3)pcDNA3.1(-)A-neutitin轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)后

4、，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)neuritin的BMSCs：(4)鏡下觀察：neuritin過表達(dá)使BMSCs形態(tài)變得不規(guī)則，多偽足，且部分細(xì)胞偽足似絲狀，更為細(xì)長(zhǎng)；(5)MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：neuritin過表達(dá)與BMSCs的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)；(6)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示：neuritin過表達(dá)對(duì)BMSCs的遷移有促進(jìn)作用。 結(jié)論：(1)篩選出neuritin高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)neuritin不僅在多種正常細(xì)胞中有表達(dá)，而且在部