Rho GTP酶家族在黑素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)及RhoD過表達(dá)對(duì)A375細(xì)胞骨架和遷移侵襲的影響及機(jī)制初探.pdf

1、皮膚惡性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是惡性程度最高的皮膚腫瘤，近年來CMM發(fā)病率在世界范圍內(nèi)以3％-7％比例逐年上升，具有進(jìn)展速度快、易于轉(zhuǎn)移、放化療不敏感、治療后易復(fù)發(fā)和預(yù)后差等特點(diǎn)。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響該疾病患者生存的首要因素，是治療的最大障礙，也是造成該疾病臨床預(yù)后極差的關(guān)鍵因素，目前CMM的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全闡明。細(xì)胞骨架重組是細(xì)胞遷移和侵襲所必需的，Rho GTPases家族是細(xì)

2、胞骨架的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展多個(gè)步驟和過程均可發(fā)揮重要作用。因此，我們以M14、A375和MV3三株人黑素瘤細(xì)胞和人黑色素細(xì)胞(Melanocyte，MC)為研究對(duì)象，探討Rho GTPases家族不同成員的表達(dá)及與細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)系，然后選取該家族中在腫瘤細(xì)胞系及MC中表達(dá)差異最明顯的RhoD為進(jìn)一步研究的目標(biāo)，構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)RhoD的A375細(xì)胞株，探討RhoD過表達(dá)對(duì)A375細(xì)胞株細(xì)胞骨架、遷移、侵襲等

3、生物學(xué)功能的影響及可能的機(jī)制。
　　本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 Rho GTPases家族在黑素瘤細(xì)胞骨架和遷移運(yùn)動(dòng)中的作用及分子機(jī)制
　　目的:黑素瘤遷移和侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者生存的關(guān)鍵因素之一，細(xì)胞骨架重組是細(xì)胞遷移和侵襲所必需的，Rho GTPases家族是細(xì)胞骨架關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究擬探討Rho GTPases家族不同成員在黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)，觀察細(xì)胞骨架的異同，揭示Rho GTPases家族

4、通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架在黑素瘤遷移和侵襲中發(fā)揮的作用和分子機(jī)制。
　　方法:1、霍夫曼顯微鏡下觀察M14、A375和MV3三株人黑素瘤細(xì)胞與人黑色素細(xì)胞(Melanocyte，MC)形態(tài)學(xué)上的差異;羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色，在超高分辨率顯微鏡下觀察以肌動(dòng)蛋白絲為主要組成成分的絲狀偽足、板狀偽足、應(yīng)力纖維和粘著斑在四種細(xì)胞中的差異。2、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M14、A375和MV3和MC四種細(xì)胞的遷移能力。3、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈

5、反應(yīng)(Quantitative Real-timePolymerase Chain Reaction，QPCR)檢測(cè)Rho GTPases家族各成員的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;免疫印跡法(western blotting，WB)檢測(cè)RhoD、Diaph2(diaphanous related formin2)、絲切蛋白Cofilin和磷酸化絲切蛋白(P-Cofilin)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1、M14、A375和MV3和MC四種細(xì)胞絲狀

6、偽足、板狀偽足、應(yīng)力纖維和粘著斑具有明顯差異。MC無應(yīng)力纖維和粘著斑，M14、A375、MV3三種黑素瘤細(xì)胞雖然形態(tài)學(xué)不同，但均含有應(yīng)力纖維和粘著斑;MV3應(yīng)力纖維的數(shù)量少于M14和A375，但較后兩者粗;四種細(xì)胞都具有極細(xì)且短的絲狀偽足。2、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M14和A375細(xì)胞跨膜遷移能力類似，遷移率高;MV3細(xì)胞遷移率低于M14和A375，MC無跨膜遷移能力。3、Rho GTPases家族的不同成員在四種細(xì)胞中的Q

7、PCR結(jié)果各不相同，并且呈現(xiàn)與細(xì)胞骨架免疫熒光相對(duì)應(yīng)的變化;WB結(jié)果顯示Rho GTPases家族成員之一的RhoD在M14、A375、MV3中基本不表達(dá)，與QPCR水平變化一致，其下游效應(yīng)因子Diaph2亦出現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的變化;肌動(dòng)蛋白絲重要調(diào)控因子cofilin蛋白雖沒有顯著變化，但是其磷酸化水平P-Cofilin在黑素瘤細(xì)胞中明顯高于黑色素細(xì)胞。
　　結(jié)論:Rho GTPases通過調(diào)節(jié)以肌動(dòng)蛋白絲為主要組成成分的絲狀偽足、板

8、狀偽足、應(yīng)力纖維、粘著斑進(jìn)而影響黑素瘤細(xì)胞遷移和侵襲;黑色素和黑素瘤細(xì)胞骨架和細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)是不同Rho GTPases家族成員精準(zhǔn)調(diào)節(jié)的結(jié)果。
　　第二部分 慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)RhoD人黑素瘤A375細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建人RhoD基因的慢病毒載體并進(jìn)行慢病毒包裝和鑒定，體外轉(zhuǎn)染人黑素瘤細(xì)胞A375，使其過表達(dá)RhoD蛋白，為后續(xù)研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1、利用Gateway技術(shù)構(gòu)

9、建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的RhoD慢病毒載體，經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定后，與輔助質(zhì)粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合采用脂質(zhì)體法制備DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物，并共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，產(chǎn)生相應(yīng)慢病毒顆粒，通過定量PCR方法測(cè)定病毒滴度。2、利用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞，建立RhoD過表達(dá)的人黑素瘤A375細(xì)胞株，熒光顯微

10、鏡下觀察熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;實(shí)驗(yàn)分為A375（未處理對(duì)照組）、A375-EGFP（不含目的基因的空病毒對(duì)照組）和A375-RhoD（含RhoD基因的病毒組）三組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)及免疫印記法（Western blot，WB）驗(yàn)證RhoD在A375-RhoD組細(xì)胞中的過表達(dá)。
　　結(jié)果:1、通過PCR、基因測(cè)序證實(shí)，慢病毒表達(dá)載體pLV[Exp]-EGFP/Neo-CMV＞hRhoD構(gòu)建成功。與輔

11、助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝出具高效感染力的慢病毒，經(jīng)測(cè)定病毒滴度為(5.13±2)×108 TU/ml。2、轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜表面都有明顯的綠色熒光表達(dá)，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率大于80％; A375-RhoD組RhoD mRNA及蛋白水平均較A375-EGFP組和A375組細(xì)胞中明顯增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建RhoD慢病毒表達(dá)載體，包裝出具高效感染力的慢病毒顆粒并成功轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞，為進(jìn)一

12、步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分 過表達(dá)RhoD對(duì)黑素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞骨架和遷移侵襲的影響及作用機(jī)制的探討
　　目的:探討RhoD對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞骨架、遷移和侵襲能力等生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，觀察空白對(duì)照組A375、陰性對(duì)照慢病毒載體轉(zhuǎn)染組A375-

13、EGFP及過表達(dá)RhoD慢病毒載體轉(zhuǎn)染組A375-RhoD三組細(xì)胞的體外生物學(xué)行為改變;采用Western blot免疫印跡法比較三組細(xì)胞中Diaph2、cofilin和P-cofilin的表達(dá)情況，分析RhoD影響黑素瘤細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)、侵襲功能的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:1、細(xì)胞骨架染色顯示，與A375和A375-EGFP組細(xì)胞對(duì)比， A375-RhoD組細(xì)胞體積增大，應(yīng)力纖維變細(xì)，軟弱無力，粘著斑增多;絲狀偽足形成增加;皺褶緣和板

14、狀偽足無明顯變化。2、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示:A375、A375-EGFP和A375-RhoD組平均每視野穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(149.67±11.93)、(152.67±11.23)和(72.67.25±5.03)，RhoD過表達(dá)可以顯著抑制黑素瘤細(xì)胞A375的跨膜運(yùn)動(dòng)和遷移能力(P＜0.05);Transwell小室人工基底膜侵襲試驗(yàn)顯示:A375、A375-EGFP和A375-RhoD組平均每視野穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（83±7

15、）、(78.33±12.34)和(9±1)，RhoD過表達(dá)可以顯著抑制黑素瘤細(xì)胞A375的侵襲能力(P＜0.05)。3、流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果表明:A375、A375-EGFP和A375-RhoD三組細(xì)胞間G1期、S期和G2期細(xì)胞所占百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.685、0.138和P=0.410），過表達(dá)RhoD和陰性對(duì)照慢病毒載體對(duì)細(xì)胞周期均無影響。5、WB免疫印跡結(jié)果顯示，A375-RhoD細(xì)胞可在RhoD的刺激下激活下游信號(hào)