ROS對仔豬支持細胞骨架的影響及機制研究.pdf

1、睪丸支持細胞(Sertoli cell,SC)對于成年動物精子的生成量具有決定性影響，所有針對睪丸的毒物均以支持細胞作為第一作用對象。睪丸支持細胞骨架參與了血睪屏障的形成、精子的釋放及物質(zhì)的運輸?shù)壬砘顒?，研究氧化?yīng)激對支持細胞骨架的影響，不僅可以進一步認識精子生成的調(diào)節(jié)機制，而且能闡明活性氧導(dǎo)致雄性不育的機制，為治療雄性不育提供依據(jù)和新的思路。本實驗以仔豬睪丸支持細胞為實驗材料，利用H2O2、細胞松弛素(CytB)模擬細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激

2、環(huán)境，研究了活性氧對細胞骨架的影響及可能的調(diào)節(jié)機制。 為了建立合適的實驗?zāi)Ｐ?，本研究首先研究了H2O2對細胞骨架的影響。通過急性實驗，確定H2O2處理的半數(shù)致死量(LD50)為617.5μmol/L。利用熒光分光光度計和熒光探針檢測H2O2處理后的細胞內(nèi)ROS水平和超氧化物陰離子的水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理明顯增加ROS和超氧化物陰離子的水平(p＜0.05)。為了檢測ROS對細胞的影響，本實驗用投射電鏡對細胞的超微結(jié)構(gòu)進

3、行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體發(fā)生腫脹，染色質(zhì)凝集，胞漿濃縮和核溢裂的現(xiàn)象并且空泡化特別明顯。進一步通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的微絲應(yīng)力纖維網(wǎng)和微絲束被破壞，出現(xiàn)微絲邊集合。 本實驗還利用細胞松弛素(CytB)模擬細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激環(huán)境。結(jié)果顯示，隨著濃度的升高，細胞內(nèi)ROS的水平顯著升高(p＜0.05)，且DHE染色后，光密度變化也與ROS變化趨勢一致。利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，當CytB濃度分別為0.1gmol/L及0.5gmol/L時

4、，微絲出現(xiàn)聚集現(xiàn)象但細胞形態(tài)完整；當濃度達到1.5μmol/L，時，微絲出現(xiàn)斷裂，甚至都成碎片，呈彌散狀。 為了研究細胞松弛素(CytB)冪H2O2在對細胞的影響中是否存相互作用，本實驗還研究了二者共同作用對微絲的影響。結(jié)果顯示在本實驗中兩者是協(xié)同作用。在添加VE后，可以削弱它們的影響。 為了研究ROS調(diào)節(jié)細胞骨架的可能機制，本實驗還研究了Sertoli細胞抗氧化能力和MAPK級聯(lián)活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞松弛素(CytB

5、)、H2O2和二者共同作用均使SOD、GSH、CAT等水平顯著下降，加入VE后幾種酶的活性明顯上升。細胞松弛素和H2O2均激活了ERK1/2和P38，加AVE抑制了ERK1/2和P38的激活。 綜上所述，本研究所得結(jié)論如下： (1)細胞松弛素和H2O2引起Sertoli細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，使細胞活力顯著下降； (2)細胞松弛素和H2O2對F-actin的分布有影響； (3)細胞松弛素和H2O2誘導(dǎo)的