FAM40A的足細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞骨架的影響.pdf

1、足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，它連同腎小球基膜(GBM)、有窗孔的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白多糖和足細(xì)胞下區(qū)共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。越來越多的研究證明足細(xì)胞在腎臟疾病的發(fā)展中有重要地位。
　　 足細(xì)胞病是指腎臟腎小球單位中的足細(xì)胞出現(xiàn)異常而導(dǎo)致的一類疾病，是出現(xiàn)蛋白尿的重要原因。2002年P(guān)ollak首次使用“足細(xì)胞病(podocytopathies)”這一名詞，將患者存在腎小球足細(xì)胞數(shù)量和（或）密度減少、基底膜增厚、腎小球

2、基質(zhì)成分改變以及足突融合為特征的腎小球疾病稱為足細(xì)胞病。經(jīng)典的足細(xì)胞病包括微小病變性腎病和局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥。
　　 局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是以局灶節(jié)段分布的腎小球硬化及足細(xì)胞變性所致足突融合或消失為主要病理特征的原發(fā)性腎小球疾病。臨床表現(xiàn)為中到大量蛋白尿、浮腫、高血壓和腎功能不全等，有相當(dāng)數(shù)量的患者對(duì)激素和免疫抑制劑等藥物治療不敏

3、感，腎功能呈進(jìn)行性惡化，最終進(jìn)展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。國外報(bào)告成人腎活檢病例中，F(xiàn)SGS占腎小球疾病的15-20％，在黑人中甚至高達(dá)64％;國內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)SGS約占腎活檢中原發(fā)性腎小球疾病的6％。近年來的數(shù)據(jù)顯示FSGS發(fā)病呈逐年增高的趨勢(shì)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療的研究也一直是當(dāng)今的熱點(diǎn)。
　　 FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和家族性/遺傳性三類。家族性局灶節(jié)段腎小球硬化癥

4、（Familial focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)FSGS）可以視為FSGS的特有類型，由于受人口學(xué)的影響及診斷措施的局限性臨床確診困難，實(shí)際的發(fā)病率并不低，據(jù)國外報(bào)道18％的FSGS是與基因突變、家族性遺傳背景有關(guān)。
　　 近二十年，人們基于對(duì)家族性FSGS的研究，發(fā)現(xiàn)了許多在足細(xì)胞和其之間的裂孔隔膜上表達(dá)的突變蛋白，這些功能蛋白絕大多數(shù)對(duì)足細(xì)胞骨架以及裂孔隔膜的完整性的保持都是非常重

5、要的。FSGS作為一種典型的足細(xì)胞病變，其損傷可以發(fā)生在多個(gè)環(huán)節(jié)上，包括細(xì)胞骨架(cytoskeleton)的破壞、細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的異常、胞漿內(nèi)線粒體能量產(chǎn)物異常、細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性的改變及裂孔隔膜上其他成分的異常等，其中足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化對(duì)足細(xì)胞的功能影響最大。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞維持生命活動(dòng)的重要組成成分，包括微絲、微管和中間絲。其中，微絲是由肌動(dòng)蛋白(actin)、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白以及肌球蛋白(myosin)三者構(gòu)成。在足細(xì)

6、胞中，微絲結(jié)構(gòu)是以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)，并與α-actinin-4、Synaptopodin和肌球蛋白等共同組成具有精細(xì)調(diào)節(jié)和收縮作用的足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲骨架。
　　 我們研究小組多年致力于家族性FSGS大家系的遺傳學(xué)研究，前期我們發(fā)現(xiàn)一5代54名成員的家族性FSGS家系，通過連鎖分析和全外顯子測(cè)序及進(jìn)一步家系內(nèi)過濾篩查，已初步確定其致病基因?yàn)镕AM40A，并以此為基礎(chǔ)成功申請(qǐng)到兩個(gè)國家自然基金（面上項(xiàng)目）的連續(xù)支持。
　　

7、對(duì)FAM40A的序列研究和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):其有21個(gè)外顯子，其編碼蛋白有837個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且可以與DNA結(jié)合，推測(cè)其為一種三次跨核膜的蛋白。其N基端富含脯氨酸，我們推測(cè)其可以與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白直接相結(jié)合而發(fā)揮特定的功能。FAM40A又被稱為STRIP1(striatin interactingprotein1).其可以編碼STRIPAK(striatin-interacting phosphatase

8、 and kinase)復(fù)合體的一種核心蛋白。而最新的有關(guān)FAM40A的研究證明:FAM40A在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞的伸展(spreading)中發(fā)揮重要作用。該基因表達(dá)水平的改變會(huì)影響到細(xì)胞形狀、肌動(dòng)蛋白絲的分布和細(xì)胞遷移。
　　 我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):應(yīng)用免疫組化(IHC)染色的方法，可見FAM40A在正常的大鼠腎小球足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞和集合管細(xì)胞均有上有表達(dá);并初步在同為典型足細(xì)胞病變且極易進(jìn)展為FSGS的膜

9、性腎病(MCD)大鼠模型(PHN)和微小病變性腎病(MCD)大鼠模型(PAN)，對(duì)FAM40A的表達(dá)進(jìn)行了觀察。
　　 據(jù)此本課題擬通過體外培養(yǎng)永生化的小鼠足細(xì)胞，結(jié)合之前我們對(duì)FAM40A的生物信息學(xué)分析，觀察其在小鼠足細(xì)胞上的表達(dá)和定位，明確FAM40A的亞細(xì)胞定位;其次應(yīng)用siRNA沉默技術(shù)，構(gòu)建FAM40A沉默的足細(xì)胞模型，觀察其沉默后對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響，確定其是否與細(xì)胞骨架相關(guān)。結(jié)果顯示:FAM40A在小鼠的腎臟足

10、細(xì)胞上有表達(dá)，其表達(dá)定位主要在細(xì)胞核內(nèi)和核周圍的胞漿中。與對(duì)照組相比，在FAM40A蛋白被沉默的足細(xì)胞模型中，F(xiàn)-actin的分布發(fā)生了明顯的變化，其主要向細(xì)胞的外圍四周分布增加，而胞漿的中央?yún)^(qū)域分布明顯減少;并且，在分化成熟的足細(xì)胞中同時(shí)伴有細(xì)胞突起的明顯減少等細(xì)胞形態(tài)的改變。而對(duì)微管蛋白α-tubulin、以及完全分化成熟的足細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期影響不大。
　　 此部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)FAM40A的缺失會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架F-actin的分布