溫陽(yáng)活血利水法對(duì)嘌呤霉素?fù)p傷足細(xì)胞的細(xì)胞骨架及相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：觀(guān)察溫陽(yáng)活血利水方含藥血清對(duì)嘌呤霉素?fù)p傷小鼠永生系足細(xì)胞組織蛋白酶L（Cathepsin L,CatL）的轉(zhuǎn)錄因子Dendrin、膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2(Membrane-associated guanylate kinase inverted2,MAGI-2）、下游底物synaptopodin、RhoA的表達(dá)變化以及足細(xì)胞骨架蛋白actin、中間絲分布情況的影響，探討溫陽(yáng)活血利水方的作用改善腎病綜合征蛋白尿及足突融合的機(jī)制。

2、
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠永生系足細(xì)胞MPC5，采用嘌呤霉素45mg/L損傷足細(xì)胞12h后分組，并設(shè)正常對(duì)照、中藥血清空白對(duì)照，具體分組如下：A.正常對(duì)照組、B.模型組、C.中藥血清空白對(duì)照組、D.地塞米松（1umol/l）組、E.10％中藥血清組、F.20%中藥血清組，孵育12小時(shí)，熒光定量 PCR檢測(cè)Synaptopodin、CatL mRNA表達(dá)變化；western blotting測(cè)定MAGI-2、Synaptopodin、

3、CatL、RhoA的蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光觀(guān)察 Dendrin、MAGI-2、Synaptopodin、CatL、RhoA的表達(dá)與分布；通過(guò)異硫氰酸熒光素(FITC）-鬼筆毒環(huán)肽(phalloidin）染色標(biāo)記足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)微絲（F-actin），觀(guān)察微絲熒光表達(dá)及結(jié)構(gòu)變化；通過(guò)vimentin染色標(biāo)記足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中間絲，觀(guān)察中間絲的熒光表達(dá)及結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：1.嘌呤霉素作用足細(xì)胞12h后，CatL mRNA表達(dá)明顯增加（

4、與正常對(duì)照比較P＜0.01）,Synaptopodin mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯變化（與正常對(duì)照比較P＞0.05）；地塞米松、10%與20%含藥血清干預(yù)后CatL mRNA表達(dá)減少（與模型組比較P＜0.01）,20%含藥血清組CatL mRNA水平低于10%含藥血清組（P＜0.01），各治療組Synaptopodin mRNA表達(dá)沒(méi)有變化（與模型組比較，均P＞0.05）。
　　2.嘌呤霉素作用于足細(xì)胞12h后，MAGI-2、RhoA、

5、Synaptopodin蛋白的表達(dá)顯著性下降（與正常組對(duì)比，均P＜0.01），CatL蛋白的表達(dá)顯著性升高（與正常組對(duì)比，P＜0.01）；地塞米松、10%及20%的中藥血清干預(yù)后，MAGI-2、RhoA、Synaptopodin蛋白的表達(dá)有所增多(與模型組對(duì)比,均P＜0.01），CatL蛋白的表達(dá)有所降低(與模型組對(duì)比,P＜0.01），但未達(dá)到正常水平（MAGI-2、RhoA、Synaptopodin、CatL蛋白與正常組對(duì)比，均 P＜

6、0.01）。20%中藥血清組 MAGI-2、RhoA、Synaptopodin蛋白水平高于10%中藥血清組(均P＜0.01），20%中藥血清組CatL蛋白水平低于10%中藥血清組(P＜0.01）。
　　3.免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)模型組中 Dendrin轉(zhuǎn)核比例增多（與正常組對(duì)比P＜0.01）;地塞米松、10%中藥血清及20%中藥血清與足細(xì)胞共孵育后Dendrin轉(zhuǎn)核比例減少（與模型組對(duì)比，均P＜0.01），但未達(dá)到正常

7、（與正常組對(duì)比，均P＜0.01）;地塞米松組與10%和20%中藥血清組比較dendrin轉(zhuǎn)核比例沒(méi)有顯著差異（均P＞0.05），而20%中藥血清組中dendrin轉(zhuǎn)核比例少于10%中藥血清組（P＜0.01）。
　　4.免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察微絲、中間絲，可見(jiàn)正常足細(xì)胞中間絲和微絲結(jié)構(gòu)清晰，排列有序，可見(jiàn)伸展的偽足。嘌呤霉素?fù)p傷足細(xì)胞12h后，模型組中足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，偽突回縮變短，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，中間絲和微絲結(jié)

8、構(gòu)紊亂，雜亂無(wú)章排列，結(jié)構(gòu)不清晰；地塞米松組、10%和20%中藥血清組中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)微絲、中間絲較模型組有所恢復(fù)，排列稍有序，出現(xiàn)偽突結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：足細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素?fù)p傷后出現(xiàn) MAGI-2表達(dá)下降，Dendrin核內(nèi)轉(zhuǎn)移，足細(xì)胞胞質(zhì) CatL水平的增加，同時(shí)胞質(zhì) CatL的底物蛋白synaptopodin表達(dá)減少，但synaptopodin蛋白的mRNA表達(dá)并沒(méi)有變化，提示 synaptopodin水平減少不是在轉(zhuǎn)錄水平，而是