嘌呤霉素敏感的氨肽酶對TauP301L誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老年癡呆中所占比例最高的一種神經(jīng)退行性疾病，患者會表現(xiàn)出進(jìn)行性記憶障礙、認(rèn)知障礙、日常生活能力下降等臨床癥狀。阿爾茨海默病在老年人中發(fā)病比較普遍。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，65歲以上的老年癡呆的患病率在5％左右，并且老年癡呆的發(fā)病與年齡成正比，在高齡人群中發(fā)病率較高。隨著我國人口老齡化的逐年加劇，老年癡呆的患病率增加，如何有效治愈老年癡呆成為醫(yī)學(xué)界乃至整個(gè)社會關(guān)注的問

2、題。
　　AD患者的腦部呈現(xiàn)出神經(jīng)元缺失以及皮質(zhì)海馬萎縮，典型的病理特征主要是大腦及海馬區(qū)的β淀粉樣蛋白(amyloidβpeptide，Aβ)在細(xì)胞外積累并形成老年斑(senile plaque，SP)、腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常聚集、出現(xiàn)由成對螺旋絲(paired helical filaments，PHF)構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neuro fibrillary tangle，NFT)，以及神經(jīng)元的缺失等。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元的缺失

3、與患者表現(xiàn)出的認(rèn)知記憶能力的下降密切相關(guān)。然而在AD患者的發(fā)病前期或者是在腦部出現(xiàn)老年斑的患者中并沒有檢測到神經(jīng)元的缺失。神經(jīng)元缺失的機(jī)制尚未得到完整的解釋，而越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡有可能是導(dǎo)致神經(jīng)元缺失的原因。West等研究發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元的缺失與病理性的Tau密切相關(guān)。在AD發(fā)病機(jī)制的研究中，病理性的Tau蛋白P301L位點(diǎn)突變能模擬AD患者腦部的NFT的出現(xiàn)以及神經(jīng)元的缺失，因而被廣泛研究。
　　嘌呤霉素敏感的氨肽酶（Pur

4、omycin-Sensitive Aminopeptidase，PSA）是分子量為110kD的高度保守的N-末端氨肽酶，屬于M1金屬肽酶家族，主要以胞漿蛋白的形式存在于大腦。PSA在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要功能，PSA因其氨肽酶的活性能夠降解具有聚集性質(zhì)的蛋白質(zhì)，像亨廷頓病中的Poly-Q，同時(shí)還降解其他神經(jīng)退行性疾病中的沉積蛋白如exon-1，ataxin-3，mutanta-synucleinandSOD1。Karsten等發(fā)現(xiàn):在體內(nèi)P

5、SA可以抑制病理性Tau引起的神經(jīng)退行性病變，當(dāng)PSA失去作用后，這種神經(jīng)病變會加重;在體外，PSA可以直接降解病變的Tau。Kudo等研究發(fā)現(xiàn)與TauP301L轉(zhuǎn)基因鼠相比，hPSA-TauP301L雙轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量增多，神經(jīng)膠質(zhì)過多癥消失，在脊髓、腦干、皮質(zhì)、海馬、小腦等部位病理性的Tau形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)減少。因此提出了增加PSA以作為治療Tau蛋白引起病變的設(shè)想，但具體的機(jī)制尚未明確。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　

6、研究嘌呤霉素敏感的氨肽酶對于TauP301L誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.構(gòu)建TauP301L表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞;
　　2.用MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒和TauP301L24h、48h和72h后的細(xì)胞存活率;
　　3.按照2中提到的方法處理細(xì)胞，用Hochst33342染色法檢測細(xì)胞的細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化;

7、　　4.把PC12細(xì)胞分成四組，分別為:pcDNA3.1組、TauP301L組、PSA組、PSA+TauP301L組，以便于檢測過表達(dá)PSA對細(xì)胞的影響;將SH-SY5Y細(xì)胞分成五組，分別為:pcDNA3.1組、TauP301L組、對照小RNA組、PSA-siRNA組、PSA-siRNA+TauP301L組，以便于檢測當(dāng)干擾掉PSA后對細(xì)胞的影響。對以上處理的各組細(xì)胞，同時(shí)用Westernblotting法檢測Caspase-3蛋白的表

8、達(dá)，酶標(biāo)儀檢測Caspase-3的活性變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.TauP301L對細(xì)胞增殖率的影響具有時(shí)間依賴性，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，與pcDNA3.1組相比，TauP301L組能顯著抑制細(xì)胞增殖率（P＜0.01）;
　　2.TauP301L轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，細(xì)胞核明顯出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化;
　　3.與pcDNA3.1組相比，細(xì)胞中轉(zhuǎn)入TauP301L后，細(xì)胞中Caspase-3的

9、活性升高（P＜0.01），活性形式表達(dá)量增加（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.01)，在PC12細(xì)胞中過表達(dá)PSA，可以使TauP301L誘導(dǎo)的Caspase-3的活性形式表達(dá)量和活性明顯下降(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.01);而在SH-SY5Y細(xì)胞中干擾PSA表達(dá)后，TauP301L誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率顯著升高，Caspase-3的活性形式表達(dá)量和活性均升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　TauP