塞來(lái)昔布對(duì)嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、足細(xì)胞(Podocyte)即腎小球臟層上皮細(xì)胞(Glomerular Visceral Epithelial Cell)，是一種具有高度特異性且終級(jí)分化的細(xì)胞，不具有增殖特性。足細(xì)胞損傷、脫落或凋亡是腎小球硬化起始和進(jìn)展的主要原因，而介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素合酶的同工酶，其表達(dá)部位在腎小球皮質(zhì)的致密斑、髓質(zhì)問(wèn)質(zhì)細(xì)胞及亨氏襻升支粗段。有研究報(bào)道在人類

2、腎小球足細(xì)胞可檢測(cè)到COX-2表達(dá)，且在腎大部切除、Thy-1腎炎、糖尿病腎病大鼠模型中足細(xì)胞COX-2的表達(dá)顯著增強(qiáng)。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明特異性COX-2抑制劑對(duì)許多慢性腎臟疾病有減輕蛋白尿，延緩腎損害進(jìn)展的作用，但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在通過(guò)特異性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)對(duì)嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin Aminonucleoside，PA)誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討特異性COX-2抑制劑對(duì)足

3、細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制，為臨床對(duì)慢性進(jìn)行性。腎損害的防治探索出新的治療靶點(diǎn)。 方法： 1.將體外培養(yǎng)的條件永生性小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)，并用PA干預(yù)足細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡，采用Western blot法分析COX-2在凋亡足細(xì)胞中的表達(dá)。為進(jìn)一步研究特異性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.以條件永生性小鼠足細(xì)胞株為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為8組：正常對(duì)照組(CON)、嘌呤霉素氨基核苷組(

4、PA)、地塞米松組(DEX)、地塞米松+嘌呤霉素氨基核苷組(DEX+PA)、氯沙坦組(LOS)、氯沙坦+嘌呤霉素氨基核苷組(LOS+PA)、塞來(lái)昔布組(CEL)和塞來(lái)昔布+嘌呤霉素氨基核苷組(CEL+PA)，在Oh，8h，24h和48h對(duì)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞分別用MTT比色法和Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)足細(xì)胞活性和凋亡水平；用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡過(guò)程中caspase-3蛋白酶的活性水平；用Western bl

5、ot技術(shù)檢測(cè)凋亡過(guò)程中p53及COX-2水平。 結(jié)果： 1.在33％增殖狀態(tài)下，足細(xì)胞呈鵝卵石狀，在37℃分化狀態(tài)下的足細(xì)胞呈分叉狀。在37℃分化14d后，用低血清培養(yǎng)液培養(yǎng)后，給予PA干預(yù)后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡逐漸增多，在24h及48h COX-2表達(dá)明顯增加。 2.與正常對(duì)照組比較，LOS、CELE、DEX組足細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05)，PA組凋亡率在24h及48h明顯增高(P<0.0

6、5)，而LOS+PA、CELE+PA、DEX+PA組凋亡率在24h及48h比正常對(duì)照組升高，但較PA組明顯下降(P<0.05)。 3.與正常對(duì)照組比較，LOS、CELE、DEX組足細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，PA組增殖活性在24h及48h明顯下降(P<0.05)，而LOS+PA、CELE+PA、DEX+PA組增殖活性在24h及48h比正常對(duì)照組下降，但較PA組明顯升高(P<0.05)。 4.各組caspase

7、-3活性無(wú)明顯差異(P>0.05)。 5.在24h及48h時(shí)，PA組p53表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增多，用LOS、CELE、DEX干預(yù)后明顯降低(P<0.05)。 6.正常對(duì)照組表達(dá)COX．2，用PA誘導(dǎo)凋亡后，24h及48h時(shí)COX-2表達(dá)明顯增加，用LOS、CELE、DEX干預(yù)后COX-2表達(dá)水平有所減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1.COX-2在凋亡足細(xì)胞中的表達(dá)呈時(shí)間依賴性。 2.塞來(lái)昔布可以