淀粉樣前體蛋白C端片段對(duì)細(xì)胞骨架的影響.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）癥狀的主要特征性標(biāo)志：腦組織病理改變?yōu)樯窠?jīng)炎性斑或老年斑（senile plaques，主要為淀粉樣肽Aβ）的形成和異常tau蛋白過度磷酸化的聚集（神經(jīng)纖維纏結(jié)，NTFs）。神經(jīng)元的細(xì)胞骨架主要由細(xì)胞內(nèi)的三種蛋白纖維絲的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，主要是微管、微絲、中間纖維，肌動(dòng)蛋白actin則是微絲的主要成分。而微管的聚合、穩(wěn)定和組裝由微管相關(guān)蛋白（Microtubule

2、-associated proteins，MAPs）調(diào)控,如MAP1，MAP2，MAP4，tau等蛋白。淀粉前體蛋白-C端片段（Amyloid Precursor Protein-C Terminal Fragment，APP-CTFs）在AD病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。APP通過β-分泌酶酶解后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生APP-CT99，APP-CT99再通過γ-分泌酶裂解后產(chǎn)生APP-CT57。為了研究淀粉樣前體蛋白C端片段是否會(huì)影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的狀

3、態(tài)，本實(shí)驗(yàn)選擇了肌動(dòng)蛋白、微管相關(guān)蛋白等蛋白作為指標(biāo)，來觀察淀粉樣前體蛋白C端片段對(duì)細(xì)胞骨架中結(jié)構(gòu)蛋白的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.胎鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)選用懷孕16～18天的SD大鼠的胎鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。
　　2.APP/APLP2-CTFs擴(kuò)增與提取分別將含有重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-APP（APLP2）-CTFs（CT99，CT57）和空載體pEGFP-N1的菌種用含Kan+培養(yǎng)

4、基擴(kuò)增培養(yǎng)。按照質(zhì)粒大量提取試劑盒說明提取、純化質(zhì)粒。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將APP/APLP2-C端片段轉(zhuǎn)染到皮層神經(jīng)元細(xì)胞中，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體 GFP，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的情況。
　　4.免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染APP-CTFs到神經(jīng)元后對(duì)F-actin、MAP2和Tubulin的影響。
　　5.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染 APP/APLP2-CTFs和它們 YENPTY段刪

5、除的CTFs后的Ph-cofilin的蛋白表達(dá)水平，以及處理DAPT組與未處理組的Ph-cofilin蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1．APP/APLP2-CTFs轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)向細(xì)胞向外伸展的F-actin的重新聚合，而對(duì)照組細(xì)胞四周的伸出的突觸卻有所收縮，免疫組化結(jié)果顯示Ph-cofilin在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有所增高；Western Blotting結(jié)果顯示兩者的Ph-cofilin表達(dá)也有所增高（P<0

6、.05）。
　　2．APP/APLP2-CTFs轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)部的Tubulin蛋白表達(dá)發(fā)生紊亂。
　　3．APP/APLP2-CTFs轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，軸突當(dāng)中的MAP2蛋白的表達(dá)顯著減弱，而且APP-C99組的MAP2蛋白的表達(dá)水平最低。
　　4．加入DAPT處理與為處理組相比，減緩了轉(zhuǎn)染APP-CTFs后產(chǎn)生Ph-Cofilin的影響（P＜0.05）。
　　5．轉(zhuǎn)染 APP-CTFs的細(xì)胞與其