貫葉金絲桃素衍生物對(duì)淀粉樣前體蛋白水解途徑的影響.pdf

1、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知和記憶減退為特征的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病原因和機(jī)制到目前為止尚未闡明，目前較公認(rèn)的淀粉樣級(jí)聯(lián)假說(shuō)認(rèn)為β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)是AD的一個(gè)關(guān)鍵起始因素，Aβ的過(guò)度聚集可以引發(fā)一系列的神經(jīng)毒性，并最終導(dǎo)致AD發(fā)生。而Aβ是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)水解代謝產(chǎn)物。當(dāng)前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一

2、便是尋找能夠抑制Aβ產(chǎn)生的藥物。
　　 貫葉金絲桃素(Hyperforin，HF)是貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)提取物中的有效成分之一，是目前天然植物的研究熱點(diǎn)。有研究表明HF能夠減少Aβ的神經(jīng)毒性以及改善記憶認(rèn)知功能，但其對(duì)APP具體水解調(diào)控及機(jī)制還缺乏深入研究。HF對(duì)光，熱，氧氣極為敏感，常溫下極易氧化，其不對(duì)穩(wěn)定性對(duì)其深入研究和藥用開(kāi)發(fā)造成了一定困難。因此以HF為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造，

3、得到化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，毒副作用小的抗AD藥物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 貫葉金絲桃素乙酸酯(hyperforin acetate，Ac-HF)和八氫貫葉金絲桃素乙酸酯(octahydrohyperforin acetate，(8H)-Ac-HF)是貫葉金絲桃素的脂溶性衍生物，具有比原型更為穩(wěn)定的理化性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，Ac-HF在神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y中能夠調(diào)節(jié)APP代謝，增加sAPPα的生成，但其在神經(jīng)元細(xì)胞中的作用及

4、其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討，同時(shí)(8H)-Ac-HF的藥理作用及機(jī)制也未見(jiàn)任何報(bào)道。
　　 目的：探討Ac-HF和(8H)-Ac-HF對(duì)皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞中APP水解調(diào)控的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：建立SD大鼠皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ac-HF和(8H)-Ac-HF對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)活力影響；利用ELSIA技術(shù)檢測(cè)Ac-HF和(8H)-Ac-HF對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清液sAPPα分泌

5、的影響；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)APP及其水解途徑重要蛋白BACE1，ADAM10表達(dá)的影響；同時(shí)檢測(cè)藥物對(duì)α-泌酶活性的影響；通過(guò)蛋白激酶C抑制劑CalphostinC(Cal.C)觀察兩種藥物可能作用的信號(hào)靶點(diǎn)。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：0-10μmol/L Ac-HF和0-50μmol/L(8H)-Ac-HF處理皮層神經(jīng)元30h對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性并沒(méi)有影響；ELSIA結(jié)果顯示Ac-HF和(8H)-Ac-H

6、F可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞sAPPα的胞外分泌水平，并且呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度相關(guān)性。并且10μmol/L Ac-HF在18 h，50μmol/L的(8H)-Ac-HF在24 h對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞sAPPα的促分泌作用效果最為明顯，與對(duì)照組相比，sAPPα分別增加至1.9倍(P＜0.01)和2.5倍(P＜0.01)。Western blot結(jié)果表明Ac-HF和(8H)-Ac-HF可以上調(diào)ADAM10表達(dá)，但對(duì)APP和BACE1的表達(dá)沒(méi)有顯著性影響；α-

7、分泌酶活性檢測(cè)結(jié)果表明10μmol/L Ac-HF和50μmol/L(8H)-Ac-HF在24h可使神經(jīng)元細(xì)胞中的α-分泌酶活性分別增加至1.36倍(P＜0.01)和1.53倍(P＜0.01)；在作用機(jī)理的研究中，0.5μmol/L蛋白激酶C(PKC)抑制劑Calphostin C(Cal.C)預(yù)處理細(xì)胞2 h后可阻斷兩種藥物對(duì)sAPPα、ADAM10和α-分泌酶的上調(diào)作用。
　　 結(jié)論：本研究在建立皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)

8、上，檢測(cè)了兩種HF衍生物對(duì)APP水解途徑的影響。Ac-HF和(8H)-Ac-HF可有效增加α-分泌酶的活性，使APP更多地經(jīng)非淀粉樣途徑水解，并能夠增加具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的sAPPα的胞外分泌水平。進(jìn)一步研究表明，其作用是通過(guò)PKC介導(dǎo)，調(diào)節(jié)APP加工，增強(qiáng)α-分泌酶的活性，增加ADAM10表達(dá)，進(jìn)而使APP通過(guò)非Aβ途徑水解，既減少了Aβ的神經(jīng)毒性，又促進(jìn)了具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的sAPPα的分泌。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明Ac-HF和(8H)-Ac-HF