POLD1-siRNA對(duì)細(xì)胞骨架及細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、DNA聚合酶d(DNA polymerase delta, Pold)是真核生物DNA復(fù)制過(guò)程中主要的復(fù)制酶之一，在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)方面起著重要的作用。Pold由POLD1基因編碼，其p125催化亞基上具有聚合酶活性和外切酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，POLD1基因異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著直接的關(guān)系，但POLD1與腫瘤遷移相關(guān)性的作用并不清楚。本研究采用小RNA干擾(small RNA interfering)技術(shù)，靶向敲低HeLa、HU

2、VEC和Chang Liver細(xì)胞中POLD1基因的表達(dá)，檢測(cè)了POLD1-siRNA對(duì)HeLa、HUVEC、Chang Liver3株細(xì)胞骨架分布的影響，初步探討了POLD1-siRNA誘導(dǎo)HeLa、HUVEC、Chang Liver3株細(xì)胞骨架與細(xì)胞遷移的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)合成針對(duì)人POLD1基因的2條siRNA序列(POLD1-siRNA1、2)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，采用MTT法檢測(cè)POLD1-s

3、iRNA對(duì)細(xì)胞活力的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　2.POLD1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，倒置顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)。
　　3.免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架中微管、微絲和中間絲及其相關(guān)蛋白a-Tubulin、γ-Tubulin、 F-actin、Cortactin、FilaminA、Vimentin、LaminB等在細(xì)胞中的分布及表達(dá)量。
　　4.免疫熒光染色觀察黏著斑相關(guān)蛋白Paxillin

4、、FAK、Src在細(xì)胞中的分布及表達(dá)量。
　　5.免疫熒光染色觀察細(xì)胞遷移中信號(hào)蛋白p125、Rho、 Cdc42等在細(xì)胞的分布及表達(dá)量，Western Blot技術(shù)檢測(cè)p125、β-actin等蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC和Chang Liver細(xì)胞72h后，對(duì)HeLa、HUVEC細(xì)胞的抑制率分別為11.38％、12.11％，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的活力顯著下降(p＜

5、0.05);對(duì)Chang Liver細(xì)胞的抑制率為21.32％，細(xì)胞活力極顯著下降(p＜0.01)。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC和Chang Liver細(xì)胞后，對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率為17.85％，細(xì)胞活力極顯著降低(p＜0.01);但對(duì)HUVEC和Chang Liver細(xì)胞活力沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05）。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比，POLD1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在48h前抑制He

6、La細(xì)胞遷移，48h后抑制能力減弱，有促進(jìn)遷移的趨勢(shì);HUVEC細(xì)胞的劃痕修復(fù)速度加快，遷移能力增強(qiáng);而Chang Liver細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力明顯減慢，遷移能力下降。
　　3.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細(xì)胞72h后，細(xì)胞呈瘦長(zhǎng)型，微管呈束狀，不對(duì)稱分布，細(xì)胞遷移前緣中微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，數(shù)量增多，決定細(xì)胞遷移的方向。細(xì)胞膜處微絲聚集、延伸，使細(xì)胞膜表面突起，形成絲狀偽足、片狀偽足，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。高表達(dá)的Vimen

7、tin是細(xì)胞遷移的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示Vimentin的表達(dá)量增加，促進(jìn)細(xì)胞遷移。但POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染Chang Liver細(xì)胞72h后，細(xì)胞中微管為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，微絲解聚呈彌散狀，Vimentin的表達(dá)量顯著下降，抑制細(xì)胞遷移。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細(xì)胞72h后，細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，出現(xiàn)絲狀偽足和片狀偽足，微管集中分布于細(xì)胞前緣，細(xì)胞質(zhì)中的微絲解聚，細(xì)胞膜處微絲聚合，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。V

8、imentin在HUVEC細(xì)胞中表達(dá)量增加，促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移。但POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染ChangLiver細(xì)胞72h后，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)片狀偽足，但細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜處微絲解聚，含量降低，同時(shí)Vimentin的含量極顯著下降，抑制細(xì)胞遷移。
　　4.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細(xì)胞72 h后，兩株細(xì)胞中FAK、Src的表達(dá)量升高，激活的FAK-Src復(fù)合物使Paxillin磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞遷移，同時(shí)HeLa

9、細(xì)胞中FAK激活后進(jìn)入細(xì)胞核中參與細(xì)胞遷移活動(dòng)的調(diào)節(jié)。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細(xì)胞72h后，F(xiàn)AK、Src在兩株細(xì)胞中的含量顯著增加，促進(jìn)細(xì)胞遷移。但FAK在HUVEC細(xì)胞的含量降低，說(shuō)明POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞沒(méi)有激活FAK。
　　5.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、 HUVEC細(xì)胞72 h后，兩株細(xì)胞中Rho的表達(dá)量都增加，調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維和片狀偽足的形成，同時(shí)HeLa細(xì)

10、胞中激活的Rho進(jìn)入細(xì)胞核，共同促進(jìn)細(xì)胞遷移。POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染Chang Liver細(xì)胞72h后，細(xì)胞中Rho的含量降低，抑制細(xì)胞遷移。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞72h后，Rho表達(dá)量增加、活化，促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　在HUVEC細(xì)胞中Rho的表達(dá)量降低，可能Rho沒(méi)參與細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。但Chang Liver細(xì)胞中Rho的含量顯著下降，抑制細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論:POLD1-siRNA1能

11、夠使細(xì)胞中FAK和Src的含量增加，從而激活FAK-Src復(fù)合物的活性，同時(shí)Paxillin蛋白被磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)HeLa、HUVEC細(xì)胞前緣黏著能力增強(qiáng)，細(xì)胞后緣黏著斑與細(xì)胞外基質(zhì)去黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。
　　POLD1-siRNA2處理HeLa和HUVEC細(xì)胞后，僅HeLa細(xì)胞是通過(guò)FAK-Src通路激活，促進(jìn)細(xì)胞遷移。HUVEC細(xì)胞中FAK表達(dá)量下降未活化。
　　POLD1-siRNA1通過(guò)小G蛋白R(shí)ho調(diào)節(jié)細(xì)胞HeLa