模擬微重力對K562細胞紅系分化及細胞骨架的影響研究.pdf

1、研究背景：
　　航天飛行會導致人體血液、消化、生殖、心血管、免疫和骨骼等多個器官系統(tǒng)的功能改變?？臻g環(huán)境對人類機體的影響已成為科學領域的研究熱點。微重力環(huán)境與地球上1g的重力環(huán)境不同，又稱零重量，它是空間環(huán)境的主要特點之一。研究航天飛行過程中微重力環(huán)境對航天員健康的影響，探討其發(fā)生機理及制定有效的防治措施已成為一項迫在眉睫的任務。血紅蛋白總量和紅細胞數量的減少、紅細胞體積的減小早在20世紀就引起了航天醫(yī)學家們的重視，他們把這種現(xiàn)象

2、稱為“航天貧血癥”(spaceflight anemia)。目前科學家們尚未能解釋這一現(xiàn)象發(fā)生的原因，但有研究表明微重力可能是通過影響造血干細胞的分化和凋亡而引起貧血現(xiàn)象。
　　紅細胞的生成是一個復雜的過程，包括造血干細胞發(fā)育為原成紅細胞再進一步分化為成熟紅細胞，期間各種細胞轉錄因子之間相互作用使得這一過程達到穩(wěn)定狀態(tài)。轉錄因子家族中GATA家族和Ets家族在紅系分化過程中起著關鍵的調控作用。GATA家族是含有鋅指結構的轉錄因子家

3、族，其中GATA-1和GATA-2主要分布在肥大細胞、T淋巴細胞、紅系和巨核系的細胞中。GATA-1是造血系統(tǒng)特有的轉錄因子，主要在紅系發(fā)育晚期表達，為正常紅細胞發(fā)育所必需，它能激活多種紅系分化特有基因，進而誘導細胞向紅系分化，并且在細胞向紅系分化時表達顯著上升。GATA-1表達的增加也是K562細胞向紅系分化成熟的一個重要標志。GATA-2則主要在多能的前體細胞中表達，對未成熟的造血細胞的增殖與維持有重要意義。過表達GATA-2會抑制

4、細胞向紅系分化，促進其向巨核系分化。Ets家族是轉錄因子家族中最大的一個家族之一，其中Ets-1在造血系統(tǒng)的調控中扮演著重要角色，它能調控淋巴細胞的生成和NK細胞的發(fā)育，在紅系分化過程中起負向調控作用。Ets-1可以通過上調GATA-2的表達從而抑制紅系分化，同時Ets-1還與GATA-2在紅系分化過程中起協(xié)同作用。綜上，任何一個轉錄因子表達異常均可能導致造血干/祖細胞紅系分化障礙。
　　細胞骨架是微管、中間纖維和微絲組成的纖維狀

5、聚合物與細胞膜上黏附斑、細胞間連接等特殊結構相互聯(lián)系，與各種調控蛋白交錯連接，并與細胞核的支架系統(tǒng)相互作用的網絡結構。微管由α和β微管蛋白組成，正常時以β二聚體即β-Tubulin形式存在，具有維持細胞形態(tài)、輔助細胞內物質運輸的功能，在真核細胞的染色體分離中發(fā)揮重要作用。中間纖維的化學組成比較復雜，主要由波形蛋白(Vimentin)構成，與核基質相互作用調節(jié)核內基因的表達影響細胞分化。微絲是一個實心狀的纖維，主要以F-actin多聚體形

6、式存在，是遷移的主要驅動力，在細胞的運動過程中起了重要的作用。細胞骨架是外力發(fā)揮作用和細胞轉導應力刺激的結構基礎，細胞可以通過細胞骨架感受重力通過物理和化學信號途徑傳導的力學信號。細胞骨架是非?；钴S的系統(tǒng)，它的單體和聚合體之間可以相互轉化發(fā)生改變，正是這種動態(tài)結構使得細胞骨架在感知微重力上發(fā)揮了重要作用。細胞的骨架蛋白表達異常會導致細胞骨架受損可影響細胞的正常形態(tài)和功能。微重力條件下細胞膜蛋白感受微重力所致的細胞骨架的變化可以激活ERK

7、、P38和JNK等下游的一系列信號轉導途徑，影響核內轉錄因子及jun、c-fos等基因的表達進而影響細胞的增殖、分化及凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)干細胞分化的改變機制與細胞骨架的改變有關。綜上，細胞骨架中任何組分發(fā)生異常導致細胞骨架破壞均可能影響細胞的增殖、分化、凋亡。因此，本實驗即通過檢測K562細胞的分化、相關轉錄因子的表達及細胞骨架的表達情況研究模擬微重力對K562細胞分化的影響及可能機制。
　　研究者目前通過航天空間站和地面模型兩種

8、方式獲得微重力來進行相關的生命科學研究。由于空間研究機會少、實驗周期長、費用昂貴不能廣泛的應用于實驗。地面微重力研究主要應用小鼠尾吊模型及微重力效應模擬裝置進行各種實驗。旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary cell culture system，RCCS)是目前公認的地面微重力效應模擬培養(yǎng)裝置，其所得實驗結果和真實微重力下實驗結果有很好的相關性，可以用來行微重力相關實驗的研究。本實驗使用第四代RCCS(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境，觀察該環(huán)

9、境下K562細胞紅系分化的情況并探索其可能機制。K562細胞株是具有向終末紅系、巨核細胞和巨噬細胞系等多向分化潛能的人紅白血病細胞。由于造血干細胞獲取困難、培養(yǎng)周期較長，K562細胞株已經被廣泛地應用于紅系分化研究模型中。氯化高鐵血紅素(Hemin)是常見的紅系分化誘導劑，可以誘導紅系祖細胞和K562細胞內血紅蛋白的合成。
　　研究目的：
　　本實驗旨在研究模擬微重力對K562細胞紅系分化的影響以進一步探究“航天貧血癥”發(fā)生

10、的可能機制。
　　研究方法：
　　本實驗采用第四代旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境，采用人紅白血病來源的K562細胞株作為造血干/祖細胞模型。實驗分為兩部分，第一部分實驗采用Hemin作為K562細胞紅系分化的誘導劑，將實驗分為正常重力(normal gravity)培養(yǎng)組（NG組），Hemin誘導組（Hemin組），模擬微重力(simulatedmicrogravity)培養(yǎng)組（SMG組）和模擬微重力下Hem

11、in誘導組（Hemin+SMG組）。培養(yǎng)K562細胞48h后采用聯(lián)苯胺染色法觀察四種培養(yǎng)條件下K562細胞內血紅蛋白的表達情況;分別培養(yǎng)K562細胞6h、12h、24h、48h后采用實時熒光定量PCR(Reverse Transcriptase-quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測四種培養(yǎng)條件下紅系分化相關轉錄因子GATA-1、GATA-2和Ets-1的mRNA表達水平。第二部分實驗分為NG組和SMG組，培養(yǎng)K562

12、細胞24h后采用間接免疫熒光法觀察兩種培養(yǎng)條件下K562細胞骨架蛋白F-actin、β-Tubulin和Vimentin的熒光強度;采用RT-qPCR法檢測6h、12h、24h、48h細胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的mRNA表達水平;Western blot法檢測12h、24h細胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達水平。本研究不同時間點之間無相關性，為獨立重復實驗，每組實驗重

13、復3次。數據分析采用SPSS20.0軟件，計量資料以均數士標準差表示，采用兩樣本t檢驗及ANOVA法分析比較，P＜0.05有統(tǒng)計學差異。
　　研究結果：
　　(1) Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率明顯高于NG組，SMG+Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率顯著低于Hemin組。
　　(2) Hemin處理K562細胞后，GATA-1基因表達水平在12h后升高，GATA-2基因表達水平在12h后降低，Ets-1基因表達水平在6h即

14、出現(xiàn)明顯降低;模擬微重力處理K562細胞后，GATA-1基因表達水平在24h后明顯降低，GATA-2基因表達水平在12h后升高，Ets-1基因表達水平在24h后出現(xiàn)明顯升高;模擬微重力和Hemin共同處理的K562細胞與單純Hemin誘導細胞比較，GATA-1基因表達水平在24h后降低，GATA-2基因表達水平無明顯改變，Ets-1基因表達水平在24h后出現(xiàn)升高。
　　(3)模擬微重力處理K562細胞后，F(xiàn)-actin、β-Tub

15、ulin和Vimentin的熒光強度較NG組均明顯減弱。
　　(4) SMG組細胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的基因表達水平在12h和24h均較NG組減少，6h和48h無明顯改變。
　　(5)SMG組細胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達水平在12h和24h均較NG組減少。
　　研究結論：
　　模擬微重力可以抑制K562細胞紅系分化。其機制可能為模擬微重