模擬微重力對K562細胞紅系分化的影響及其機制研究.pdf

1、近年來,人類向空間領(lǐng)域的開發(fā)競爭日益激烈,2003年我國“神舟”五號載人飛船成功發(fā)射,揭開了中國載人航天工程的新篇章。與此同時,人們越來越關(guān)注空間飛行給航天員帶來的影響。已知的空間環(huán)境中,微重力、輻射以及磁場環(huán)境對人類的影響最大,而在這些因素當中,微重力的影響最為顯著。研究發(fā)現(xiàn),航天員在微重力環(huán)境下,會出現(xiàn)“航天飛行性貧血”,主要表現(xiàn)為紅細胞數(shù)量和血紅蛋白減少。這種空間飛行對航天員的不利影響,仍然是長期載人航空探索的主要障礙之一。因此研

2、究“航天飛行性貧血”的發(fā)病機制及其救治方法成為當前的熱點?？臻g航天飛行研究和地面模擬微重力實驗均表明微重力能抑制造血干/祖細胞的增殖、分化和功能。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)模擬微重力能抑制臍血CD34+造血干/祖細胞的紅系分化。這提示航天飛行時抑制紅細胞生成是紅細胞數(shù)量減少原因之一。
　　 目前,人們越來越重視絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在造血分化中的作用。MAPK是一

3、組通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)將細胞外信號從細胞膜轉(zhuǎn)導至細胞核的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK在細胞增殖、分化、遷移和凋亡中具有重要作用。在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)和克隆了細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)/應(yīng)激激活的蛋白激酶(stress activated proteinki

4、nase,SAPK)、p38等三個MAPK亞家族。研究表明ERK和p3g MAPK都參與造血分化的調(diào)控。各種造血細胞分化調(diào)節(jié)因子,如造血細胞因子,白細胞介素和細胞集落刺激因子等都能激活ERK和p38 MAPK。最近有研究發(fā)現(xiàn)微重力通過減少ERK1/2的磷酸化和增加p38 MAPK磷酸化,抑制人間充質(zhì)干細胞的成骨分化。微重力是否通過影響MAPK,來調(diào)節(jié)紅系分化?有關(guān)這方面的研究,目前尚未見報道。
　　 轉(zhuǎn)錄因子能通過調(diào)控大量紅系相

5、關(guān)基因的表達,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上高效調(diào)節(jié)紅系分化。紅系珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(globin transcription factor1,GATA-1)是一種鋅指結(jié)構(gòu)核蛋白,在調(diào)節(jié)珠蛋白和其他紅系基因的轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵作用。GATA-1(-/-)小鼠在妊娠中期即死于紅細胞成熟障礙所致的嚴重貧血。研究報道,熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)通過阻止caspase-3介導的GATA—1降解,調(diào)節(jié)紅細胞生成。此外G

6、ATA-1還能調(diào)節(jié)多能造血干細胞的分化成熟。因此GATA-1的表達水平對于紅系分化具有重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)模擬微重力能抑制臍血CD34+造血干/祖細胞的GATA-1 mRNA的表達。這表明微重力可能通過影響GATA-1的表達,抑制紅系分化。但目前對于微重力抑制GATA-1表達的機制尚不明確?；虮磉_調(diào)控可在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、和翻譯后多等級水平上進行,但DNA轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵控制點。從轉(zhuǎn)錄水平上研究微重力對G

7、ATA-1表達調(diào)控的影響,將有助于闡明微重力抑制造血干細胞紅系分化的機制。
　　 紅細胞生成還由凋亡信號和存活信號共同調(diào)節(jié)。大量研究表明ERK1/2信號能夠促進細胞存活。ERK的抗凋亡機制可能有:①活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1。②活化Bcl-2家族成員:RAS-RAF-MEK-ERK途徑參與了Bcl-2的磷酸化。③活化CDK2、CDK4:CDK2與CDK4是促進細胞進入G1期與S期的關(guān)鍵因子,兩者在Raf被激活時均增加。④活化NF-κB

8、:MEK通過受體相互作用蛋白(RIP)參與活化NIK,最后促進NF-κB的活化,可誘導生存基因表達。研究發(fā)現(xiàn),抑制ERK1/2的活性,能誘導CD34+紅系祖細胞凋亡,導致分化完全受抑。與ERK1/2不同,細胞損傷刺激通過激活p38 MAPK,誘導細胞凋亡。p38MAPK至少通過以下途徑調(diào)控凋亡:①增強c-myc表達。②磷酸化p53③參與Fas/FasL介導的凋亡。④激活c-jun和c-fos。⑤誘導bax轉(zhuǎn)位。⑥增強TNF-α表達,活化

9、p8MAPK,誘導凋亡。此外,GATA-1也能通過調(diào)節(jié)Bcl-xL的表達,抑制猾亡,促進細胞存活。
　　 目前,研究微重力對細胞的影響及其機制主要有兩種策略,一種是傳統(tǒng)的基于單分子研究的方式,另一種是包涵“組學”概念的新方法。傳統(tǒng)單分子研究策略,研究問題集中,容易深入,可以比較透徹地回答一個點上的問題,但是若將這個結(jié)果放到一個體系層面上,其功能又變得撲朔迷離。而使用“組學”的方法,能從整體上把握,系統(tǒng)地研究和解決問題。在本研究中

10、,我們希望對微重力影響細胞的作用有一個系統(tǒng)觀念,并形成持續(xù)研究的框架。運用“組學”策略可能更有效和容易描繪出微重力影響細胞的機制。因此我們用蛋白質(zhì)組學策略研究微重力對細胞的影響。
　　 由于蛋白質(zhì)組學研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點,因此可以有效分析細胞內(nèi)的整體蛋白質(zhì)。然而整個細胞或組織的蛋白組成極其復(fù)雜,直接對其進行蛋白質(zhì)組學分析,往往會丟掉很多蛋白質(zhì)信息,由此衍生出了亞細胞蛋白質(zhì)組學。亞細胞蛋白質(zhì)組就是利用蛋白質(zhì)組學研

11、究技術(shù)來分析一種組織或細胞的某一亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)組成,它一方面可以降低樣品的復(fù)雜度,使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應(yīng)亞細胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白,并且可以部分提示蛋白質(zhì)的定位和功能信息。
　　 細胞核是遺傳物質(zhì)的主要存在部位,基因信息在這里存儲管理,并根據(jù)細胞的生命活動而被轉(zhuǎn)錄出來,從而使細胞適應(yīng)內(nèi)環(huán)境和本身生命周期的改變,是細胞生命活動的控制中心。核內(nèi)的蛋白質(zhì)組主要由核骨架蛋白、核膜蛋白、核仁蛋白、參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程的蛋白、

12、參與染色體形成的組蛋白和非組蛋白組成,共同參與細胞核內(nèi)的功能事件,執(zhí)行細胞核的功能。當細胞受到某種刺激后,信號從胞外傳遞到胞內(nèi),通過改變細胞內(nèi)已有蛋白質(zhì)的修飾或結(jié)構(gòu)狀態(tài),使這些蛋白質(zhì)激活或失活,從而做出即刻的反應(yīng),也有一部分蛋白質(zhì)穿梭出入細胞核,共同參與某些基因的表達,以對外界刺激做出長效的反應(yīng)。因此,通過了解微重力作用下核內(nèi)蛋白質(zhì)組的變化,有助于我們了解微重力抑制造血分化的機制。
　　 本研究我們用RCCS模擬微重力,研究微重

13、力對K562細胞紅系分化的影響及其機制。(1)首先我們用hemin誘導K562細胞,建立紅系分化模型,研究微重力對K562細胞紅系分化和凋亡的影響。通過western blot檢測微重力作用下ERK1/2和p38磷酸化水平變化,運用RT-PCR和western blot檢測微重力作用下GATA-1 mRNA和蛋白表達的變化,探討微重力影響紅系分化的機制。(2)接著我們研究微重力影響GATA-1 mRNA表達的機制。我們通過生物信息學分析

14、,找到GATA-1啟動子的可能序列,通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了GATA-1啟動子報告基因重組質(zhì)粒pGL3-GATA-1P,通過轉(zhuǎn)染K562細胞檢測其轉(zhuǎn)錄活性。(3)最后我們運用雙向電泳篩選微重力作用下K562細胞核的差異蛋白,用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)鑒定,并對差異蛋白的相互作用進行了生物信息學分析。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)模擬微重力能抑制hemin誘導的K562細胞紅系分化,并誘導細胞凋亡。模擬微重力能抑制ERK1

15、/2磷酸化,促進p38磷酸化,并抑制GATA-1mRNA和蛋白的表達。因此,微重力抑制紅系分化可能涉及ERK1/2失活、p38激活和GATA-1表達下降。接著我們成功構(gòu)建了GATA-1啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告基因載體pGL3-GATA-1P,研究發(fā)現(xiàn)模擬微重力作用下pGL3-GATA-1P轉(zhuǎn)錄活性下降,進一步證實了模擬微重力能抑制GATA-1的表達,為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。此外我們還用雙向電泳技術(shù)建立了模擬微重力作用下,K562細胞核差異