雷帕霉素對K562細胞P13K-AKT-mTOR通路的影響及其作用機制.pdf

1、目的:雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制侵襲、抑制血管生成等作用。雷帕霉素的主要作用機制是與免疫親和蛋白(FKBP12)結合形成RAPA-FKBP12復合物，作用于哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)上從而阻斷細胞信號傳導，從而減少其下游分子4EBP-1、P70S6KB的表達，進而影響細胞周期和蛋白的合成以促進細胞凋亡并抑制腫瘤細胞的增殖，并且通過抑制VEGF、HIF1α的表達抑制血管新生和降低

2、腫瘤細胞的侵襲性及轉移。
　　慢性粒細胞白血病是一種骨髓增殖性腫瘤，95％的CML患者具有BCR/ABL融合基因陽性。雖然TKIs應用使CML的治療取得了重大的突破，但其存在耐藥問題，因此需要尋找其他的治療方法。
　　本實驗擬在研究雷帕霉素對K562細胞的PI3K/AKT/mTOR途徑的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的影響，及通過電鏡了解應用雷帕霉素后K562細胞形態(tài)學的變化，并通過酶組織化學染色了

3、解雷帕霉素對K562細胞溶酶體及線粒體的影響。為雷帕霉素治療慢性粒細胞白血病提供理論基礎和依據(jù)。
　　方法:體外培養(yǎng)K562細胞，在不同濃度雷帕霉素中干預24h，應用CCK8法檢測雷帕霉素對K562細胞的抑制作用。根據(jù)CCK8的檢測結果分別選取0nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L濃度的雷帕霉素處理K562細胞24h，后采用Western Blot方法檢測4EBP1、VEGF分子的表達情況，采用R

4、T-PCR方法檢測PI3K/AKT/mTOR途徑的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的表達情況及BCR/ABL和SHIP的表達情況;應用電鏡及NADH染色、酸性磷酸酶(ACP)染色了解雷帕霉素對K562細胞形態(tài)學及線粒體、溶酶體的影響。
　　結果:
　　1.隨著雷帕霉素濃度的增高對K562細胞的抑制率明顯上升(P＜0.05）。
　　2.隨著雷帕霉素濃度增高4EBP1、VEGF在蛋白水平的表達降低(

5、P＜0.05)。
　　3.隨著雷帕霉素濃度的增高4EBP1、P70S6BK、VEGF、HIF1α分子在mRNA水平表達明顯降低(P＜0.05)。
　　4.隨著雷帕霉素濃度的增高細胞在電鏡下出現(xiàn)的凋亡程度加重，在酶組織化學染色顯示對溶酶體及線粒體細胞損傷加重。
　　5.雷帕霉素對SHIP基因和BCR/ABL融合基因(P＞0.05）無明顯作用。
　　結論:
　　1.雷帕霉素可以抑制K562細胞的生長，促進K56