索拉非尼對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌PI3K-AKT及MAPK信號(hào)通路異?；罨霓卓棺饔?pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是國(guó)內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。肝癌肝移植作為一種有效的治療手段已在全球廣泛開展,但是移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是限制患者長(zhǎng)期存活的主要因素。找尋預(yù)防和治療肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效手段將有助于提高肝癌肝移植的療效。
　　近年來,多種分子靶向藥物在臨床腫瘤治療中取得了良好效果。針對(duì)肝癌細(xì)胞中異常激活的,與其生長(zhǎng)、增殖、侵襲以及血管生成等行為密切相關(guān)的信號(hào)通路,采用分子靶向藥物的輔助治療為肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療

2、提供了新的可能。雷帕霉素作為一種免疫抑制劑已被有效的用于肝移植術(shù)后的抗排斥治療,而其作為一種mTOR抑制劑,其抗腫瘤活性已被多個(gè)研究證實(shí)。但雷帕霉素的耐藥問題,仍是限制其臨床抗腫瘤應(yīng)用的一大障礙。尋求其他治療方式與雷帕霉素聯(lián)合,從而使雷帕霉素具有的抗排斥及抗腫瘤的雙重優(yōu)勢(shì)有機(jī)結(jié)合,將為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)防提供良好的思路。索拉非尼是一種多激酶抑制劑,在抑制MAPK(Ras/Raf/MEK/ERK)通路的同時(shí),還可抑制多種受體酪

3、氨酸激酶的活性,達(dá)到良好的抗腫瘤效應(yīng),其安全性及有效性己被廣泛認(rèn)可。本研究立足于此,旨在探討肝癌細(xì)胞對(duì)雷帕霉素耐藥的機(jī)制以及聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼對(duì)雷帕霉素耐藥的拮抗。在本研究中首先觀察到人肝癌細(xì)胞株對(duì)雷帕霉素單用存在的耐藥現(xiàn)象;耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生與雷帕霉素應(yīng)用導(dǎo)致的P13K/AKT、MAPK信號(hào)通路的反饋激活密切相關(guān);索拉非尼可有效的拮抗雷帕霉素導(dǎo)致的P13K/AKT、MAPK異常激活,增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制;最后在一種潛在的大鼠原位肝癌肝移

4、植模型中探討雷帕霉素與索拉非尼的協(xié)同抗瘤作用。
　　第一部分，雷帕霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的影響
　　目的:觀察雷帕霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、HCC-LM3生長(zhǎng)增殖的作用。
　　方法:應(yīng)用MTT法檢測(cè)雷帕霉素在不同藥物濃度(0-100ng/ml)和不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)下對(duì)HepG2、HCC-LM3肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的抑制作用。
　　結(jié)果:雷帕霉素對(duì)HepG2及HCC-LM3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖存在

5、抑制作用,且呈一定的時(shí)間和劑量依賴性;但雷帕霉素對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用并不理想,即使較大劑量(100ng/ml)作用較長(zhǎng)的時(shí)間(72h)其抑制率也在35％以下(HepG228.4％;HCC-LM334.1％)。
　　結(jié)論:雷帕霉素對(duì)肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用并不理想,提示肝癌細(xì)胞對(duì)雷帕霉素存在耐藥性。
　　第二部分，雷帕霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞P13K/AKT和MAPK通路的激活
　　目的:探討人肝癌細(xì)胞株對(duì)雷帕霉素耐藥的機(jī)制。<

6、br>　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌細(xì)胞株,分別予不同藥物濃度的雷帕霉素處理2h或同一藥物濃度(50ng/ml)處理不同的時(shí)間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-p44/42MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)和PDGFR-β的變化情況;采用P13K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后,觀察雷帕霉素(50ng/ml,2h)作用對(duì)phospho-A

7、KTser473、phospho-ERK1/2的影響;采用雷帕霉素(10ng/ml)作用24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測(cè)PDGFR-α、PDGFR-β的表達(dá)。
　　結(jié)果:雷帕霉素對(duì)HCC-LM3和HepG2細(xì)胞總AKT、總ERK表達(dá)無明顯影響。雷帕霉素對(duì)肝癌細(xì)胞AKT的激活是一個(gè)快速反應(yīng)并長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的過程,并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性。較低劑量雷帕霉素作用短時(shí)間(10ng/ml,2h)對(duì)HCC-LM3和HepG2細(xì)胞E

8、RK磷酸化水平的上調(diào)作用不明顯,但當(dāng)藥物濃度提高或作用時(shí)間延長(zhǎng),ERK異常激活水平就明顯上升,并呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間相關(guān)性。P13K抑制劑LY294002的應(yīng)用可引起肝癌細(xì)胞AKT及ERK活化水平的下調(diào);采用LY294002預(yù)處理細(xì)胞后再給予雷帕霉素處理,未觀察到磷酸化AKT水平的升高,但對(duì)腫瘤細(xì)胞ERK仍存在異常激活效應(yīng),但強(qiáng)度有下降。雷帕霉素在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平均上調(diào)了PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2細(xì)胞中的表達(dá),以對(duì)

9、HepG2細(xì)胞PDGFR-β表達(dá)的上調(diào)最為明顯。
　　結(jié)論:雷帕霉素呈時(shí)間與劑量依賴性異常激活A(yù)KT、ERK;AKT的異常激活呈P13K依賴性,而ERK的激活為P13K部分依賴;PDGFR-β的表達(dá)水平上調(diào)可能是雷帕霉素異常活化AKT和ERK的重要原因。
　　第三部分，索拉非尼對(duì)雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信號(hào)通路的抑制作用
　　目的:觀察索拉非尼單用以及與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的抑制作用;探

10、討索拉非尼對(duì)雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信號(hào)通路的抑制作用及其機(jī)制。
　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌細(xì)胞株,應(yīng)用MTT法觀察索拉非尼在不同藥物濃度(0-15μM)和不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)下對(duì)生長(zhǎng)增殖的抑制作用;應(yīng)用MTT法,觀察不同濃度的索拉非尼(0、2、5、10μM)與雷帕霉素(10ng/ml)聯(lián)合作用在不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)下對(duì)生長(zhǎng)增殖的抑制作用;分別予不同藥物濃度的索

11、拉非尼單獨(dú)處理細(xì)胞2h或同一藥物濃度(5μM)處理不同的時(shí)間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2和PDGFR-β的變化情況;雷帕霉素(50ng/ml)與不同濃度的索拉非尼聯(lián)合作用2h,以及雷帕霉素(10ng/ml)與索拉非尼(5μM)聯(lián)合作用不同時(shí)間,Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況。索拉非尼

12、(5μM)單用,以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)作用細(xì)胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測(cè)PDGFR-β的表達(dá)。
　　結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼能明顯增強(qiáng)雷帕霉素對(duì)HCC-LM3和HepG2生長(zhǎng)增殖的抑制,且抑制作用的增強(qiáng)呈明顯時(shí)間與劑量依賴性。通過Westemblot和RT-PCR結(jié)果顯示,索拉非尼單用可呈劑量與時(shí)間依賴地抑制肝癌細(xì)胞ERK的活化,對(duì)AKT活化的也存在明顯抑制效應(yīng),但抑

13、制效應(yīng)的劑量或時(shí)間依賴性較弱;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼在低濃度作用短時(shí)間(2μM,2h)時(shí)就能明顯的抑制雷帕霉素導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞AKT、ERK異常的激活,并且其抑制效應(yīng)呈明顯的劑量與時(shí)間依賴性。索拉非尼單用可明顯下調(diào)PDGFR-β在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá);聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼明顯下調(diào)了雷帕霉素導(dǎo)致的PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2細(xì)胞中的過表達(dá)。
　　結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼后,可明顯增強(qiáng)雷帕霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用。單獨(dú)應(yīng)用索拉非尼

14、可抑制肝癌細(xì)胞AKT及ERK的活化。聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼有效的抑制雷帕霉素導(dǎo)致的AKT及ERK的異常激活,這種抑制作用可能與索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞PDGFR-β表達(dá)及活化的雙重抑制密切相關(guān)。
　　第四部分，雷帕霉素及索拉非尼對(duì)大鼠肝細(xì)癌體外和體內(nèi)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討雷帕霉素及索拉非尼對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株Morrishepatoma3924A(MH3924A)的體外作用及對(duì)大鼠原位肝癌模型的體內(nèi)作用。
　　方法:應(yīng)用MTT

15、法觀察索拉非尼、雷帕霉素單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用在不同藥物濃度和不同作用時(shí)間對(duì)MH3924A大鼠肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的體外抑制作用;分別予不同藥物濃度的雷帕霉素、索拉非尼、雷帕霉素+索拉非尼處理2h或同一藥物濃度處理不同的時(shí)間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況;采用P13K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后,觀察雷帕霉素(50ng/ml,2h)、索拉非尼(5μM,

16、2h)、雷帕霉素(50ng/ml,2h)+索拉非尼(5μM,2h)應(yīng)用對(duì)phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的影響;采用雷帕霉素(10ng/ml),索拉非尼(5μM),以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)分別作用細(xì)胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測(cè)。Pdgfr-α、Pdgfr-β的表達(dá)。建立ACI大鼠原位肝癌模型,將大鼠隨機(jī)分為雷帕霉素組、索拉非尼組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組4組后分別處理

17、;定期采用腹部彩超測(cè)量移植瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線;用藥結(jié)束后,觀察腫瘤生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移情況,HE染色比較各組腫瘤壞死程度,PCNA染色觀察腫瘤細(xì)胞增殖情況;提取動(dòng)物腫瘤蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況。
　　結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雷帕霉素對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株MH3924A生長(zhǎng)增殖的抑制效果不理想;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼后明顯增強(qiáng)了雷帕霉素對(duì)MH3924A生

18、長(zhǎng)增殖的抑制作用。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示,雷帕霉素呈時(shí)間與劑量依賴性地上調(diào)MH3924A細(xì)胞AKT及ERK活化水平;采用LY294002預(yù)處理MH3924A細(xì)胞后再給予雷帕霉素處理,未觀察到磷酸化AKT水平的升高,但對(duì)腫瘤細(xì)胞ERK仍存在異常激活效應(yīng),盡管強(qiáng)度有下降。單用索拉非尼對(duì)MH3924A細(xì)胞ERK的活化明顯抑制,但對(duì)AKT抑制強(qiáng)度較弱,且無明顯的劑量或時(shí)間依賴性;索拉非尼對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)異?；罨腁KT和ERK的抑制作

19、用明顯,且存在時(shí)間與劑量依賴性。通過RT-PCR顯示,雷帕霉素上調(diào)了MH3924A細(xì)胞Pdgfr-α和Pdgfr-β的表達(dá);索拉非尼單用可明顯下調(diào)Padgfr-β在MH3924A細(xì)胞中的表達(dá),但對(duì)Pdgfr-α表達(dá)的下調(diào)作用不明顯;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼明顯下調(diào)了雷帕霉素導(dǎo)致的Pdgfr-β和Pdgfr-α在MH3924A細(xì)胞中的過表達(dá)。在大鼠原位肝癌模型中觀察到,雷帕霉素或索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用,對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用;但雷帕霉素單用對(duì)腫

20、瘤肺轉(zhuǎn)移、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等抑制作用并不明顯。聯(lián)合用藥明顯增強(qiáng)了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制;聯(lián)合用藥組腫瘤壞死及腫瘤細(xì)胞的增殖抑制程度也顯著強(qiáng)于單獨(dú)用藥組;雷帕霉素組腫瘤ERK和AKT的活化水平明顯高于對(duì)照組;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼在體內(nèi)也可明顯下調(diào)雷帕霉素導(dǎo)致ERK和AKT的異常激活
　　結(jié)論:雷帕霉素與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)了對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株及原位肝癌模型的抗瘤作用;抗瘤作用的增強(qiáng)與索拉非尼對(duì)雷帕霉素導(dǎo)致的AKT和IMAPK活化的抑制密