PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控孕激素對子宮內(nèi)膜癌的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率正逐年增高，其中75％-85％的I型子宮內(nèi)膜癌為內(nèi)膜樣腺癌，孕激素大量、長期應(yīng)用為子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌保守治療的主要方法。但大劑量孕激素保守治療有效率均只有70％左右，對于這類孕激素治療失敗的患者，即使年輕尚有生育要求的子宮內(nèi)膜不典型增生過長婦女，也不得不切除子宮，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量并增加醫(yī)療支出。如何提高I型子宮內(nèi)膜癌孕激素治療敏感性，保留患者的生育功能一直是課題組關(guān)注的焦點(diǎn)所在。同時(shí)能量代謝異常者子宮內(nèi)膜癌

2、高發(fā)生率，高耐藥率的現(xiàn)象提示，細(xì)胞能量代謝失衡與子宮內(nèi)膜癌PR耐藥機(jī)制可能相關(guān)。
　　孕激素作用的經(jīng)典通路為與孕激素受體(progesterone receptor，PR)結(jié)合后，以二聚體形式與孕激素反應(yīng)元件(progesterone response element，PRE)相結(jié)合，通過募集共激活子、普通轉(zhuǎn)錄因子和共抑制子與PRE啟動(dòng)子相結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，激活靶細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，但孕激素對內(nèi)膜癌細(xì)胞具有促進(jìn)或抑制

3、增生雙向作用的現(xiàn)象并不能用孕激素受體經(jīng)典通路來解釋。近些年的研究提示激素受體普遍存在非轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這些“非基因”途徑不依賴基因轉(zhuǎn)錄或蛋白合成，而是與激素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)。在孕激素核受體缺失的內(nèi)膜癌細(xì)胞，孕激素可能通過不由孕激素核受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的非經(jīng)典途徑，促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生。
　　有研究提示乳腺癌中胰島素樣生長因子受體(IGF-1 R)和ER的串話調(diào)節(jié)誘導(dǎo)快速非經(jīng)典通路ER信號(hào)途徑激活，導(dǎo)致絲裂原活化蛋

4、白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol-3 kinase(PI3K)-serine/threonine protein kinase B(PKB or Akt)活化，促使乳腺癌細(xì)胞增殖，這提示在調(diào)控細(xì)胞增生、周期、凋亡、轉(zhuǎn)移等許多過程中起重要作用的P13K/Akt通路參與激素受體非經(jīng)典通路。有關(guān)孕激素可激活PI3K/Akt通路，阻斷孕激素核受體不能完全消除孕激素對PI3K/Akt通路

5、激活作用的現(xiàn)象提示，孕激素可不經(jīng)孕激素核受體介導(dǎo)，直接激活PI3K/Akt通路。探討PI3K/Akt是否參與調(diào)控孕激素對子宮內(nèi)膜癌作用及其中的作用機(jī)制對于進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜癌孕激素治療不敏感的機(jī)制，提高臨床保守治療成功率具有重大的指導(dǎo)意義。
　　本研究利用分化好、雌孕激素受體陽性、對孕激素反應(yīng)良好的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系、分化低、雌孕激素受體陰性、對孕激素反應(yīng)低下的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系及以MPA為誘導(dǎo)劑，采用持續(xù)作用、梯度遞增的方法誘導(dǎo)獲得

6、的孕激素耐藥的內(nèi)膜癌lshikawa細(xì)胞亞系，探討PI3K/Akt參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥的可能機(jī)制及與能量代謝相關(guān)基因的關(guān)系。
　　本課題共分三部分：Ⅰ、孕激素對孕激素敏感或耐藥人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路的不同影響；Ⅱ、通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥的機(jī)制；Ⅲ、利用反向蛋白芯片研究子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥株基因表達(dá)以及二甲雙胍逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥的初步研究
　　第一部分孕激素對孕激素敏

7、感或耐藥人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PI3K/Akt的不同影響
　　目的檢測孕激素對不同PR表達(dá)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響，及與孕激素耐藥發(fā)生的關(guān)系。
　　方法利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，HEC-1A細(xì)胞以及MPA為誘導(dǎo)劑，采用濃度遞增(1-10μM)、持續(xù)給藥的方法由Ishikawa誘導(dǎo)建立的子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細(xì)胞(progestin-R Ishikawa)，以SRB法檢測孕激素對不同細(xì)胞內(nèi)膜癌細(xì)胞株增

8、殖的影響；RT-PCR技術(shù)及Western blot檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)PR的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)；Western blot技術(shù)檢測MPA對不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株P(guān)I3K/Akt通路活性影響；利用SiRNA技術(shù)基因沉默或質(zhì)粒過表達(dá)PR基因后檢測孕激素對不同內(nèi)膜癌細(xì)胞株P(guān)I3K/Akt信號(hào)通路活性影響及治療效果比較。
　　結(jié)果(1)不同PR表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素治療敏感性不同：1、10、20μM的MPA對于Ishikawa細(xì)

9、胞抑制率分別為17.8％，22，3％及32.9％，具有劑量抑制效應(yīng)，但對于HEC-1A細(xì)胞和Progestin-R Ishkawa細(xì)胞沒有明顯抑制作用。(2)孕激素對于孕激素敏感與耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/Akt通路活性影響不同：孕激素治療可激活progestin-R Ishikawa及HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞磷酸化Akt(pAkt)表達(dá)，但抑制Ishkawa細(xì)胞pAkt表達(dá)。(3)子宮內(nèi)膜癌孕激素對PI3K/Akt通路活性的影響

10、與PR表達(dá)水平相關(guān)：Progestin-R Ishkawa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)PR后，孕激素可抑制細(xì)胞PI3K/Akt通路；Ishkawa細(xì)胞SiRNA沉默PR基因后，孕激素可快速激活細(xì)胞PI3K/Akt通路。
　　結(jié)論長期孕激素治療會(huì)導(dǎo)致孕激素敏感子宮內(nèi)膜癌PR表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致孕激素耐藥。在PR陰性或低表達(dá)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，孕激素可不通過孕激素受體經(jīng)典通路而直接激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增生。
　　第二部分抑制PI

11、3K/Akt通路可上調(diào)PR表達(dá)，逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥
　　目的探討抑制PI3K/Akt通路與逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥的關(guān)系。
　　方法以PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，采用Western blot方法檢測LY294002作用0、24、48、72、96小時(shí)后細(xì)胞PR的蛋白表達(dá)；MPA及LY294002單用或聯(lián)合作用于不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，采用SRB法檢測細(xì)胞增殖；應(yīng)用子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型檢

12、測MPA及LY294002單用或合用對子宮內(nèi)膜癌移植瘤的不同治療效果。
　　結(jié)果(1)抑制孕激素耐藥PI3K/Akt信號(hào)通路可促使孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PR表達(dá)增強(qiáng)；(2)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可有效抑制孕激素敏感及耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，對孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制增殖作用更為顯著：10μM MPA及1μM LY294002，10μM MPA及5μM LY294002對Ishikawa，progestin-R Ish

13、ikawa以及HEC-1A的抑制率分別為33.7％、49.5％、48.1％和44.5％、70.8％、60.9％；(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥，且孕激素和PI3K抑制劑聯(lián)用可更有效抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的增殖：MPA及LY294002聯(lián)合用藥組的裸鼠皮下移植瘤重量與空白對照組相比，分別減少了42.3％、61.5％和48.9％(P<0.05)。
　　結(jié)論抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)

14、胞的PI3K/Akt信號(hào)通路，可以上調(diào)PR表達(dá)，恢復(fù)孕激素受體經(jīng)典信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥。孕激素和PI3K抑制劑聯(lián)用可更有效地運(yùn)用于治療孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌。
　　第三部分利用反向蛋白芯片研究孕激素耐藥內(nèi)膜癌細(xì)胞基因表達(dá)特點(diǎn)及二甲雙胍逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥的初步研究
　　目的檢測二甲雙胍對子宮內(nèi)膜癌尤其是孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響，并檢測與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系。
　　方法利用反向蛋白芯片分析(reverse

15、 phase protein array，RPPA)技術(shù)比較孕激素敏感與耐藥內(nèi)膜癌細(xì)胞115個(gè)在增殖或凋亡中起重要作用的因子；以Western blot法檢測孕激素敏感及耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中生長因子系統(tǒng)IGF-1R的表達(dá)；二甲雙胍處理孕激素敏感及耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后，以SRB法檢測孕激素對不同內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響，Western法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AMPK的蛋白水平變化，RT-PCR技術(shù)及Western blot法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PR

16、的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果(1)孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中IGF-1R相關(guān)通路過度激活；(2)二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素耐藥；(3)二甲雙胍逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥的作用與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路及上調(diào)PR表達(dá)相關(guān)。
　　結(jié)論二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素耐藥，該作用可能與改變能量感受器AMPK表達(dá)，抑制PR非經(jīng)典途徑PI3K/Akt信號(hào)通路，恢復(fù)PR經(jīng)典途徑相關(guān)。
　　上述結(jié)果提示

17、：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素不經(jīng)PR轉(zhuǎn)錄而直接激活PI3K/Akt信號(hào)通路的機(jī)制在孕激素耐藥發(fā)生中起重要作用。PR表達(dá)量變化是調(diào)控孕激素對內(nèi)膜癌細(xì)胞PR經(jīng)典途徑或非經(jīng)典PI3K/Akt途徑的關(guān)鍵。長期孕激素治療會(huì)導(dǎo)致孕激素敏感子宮內(nèi)膜癌PR表達(dá)下調(diào)，隨著PR表達(dá)丟失，子宮內(nèi)膜癌PR經(jīng)典途徑受抑制，非經(jīng)典途徑占主導(dǎo)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞由激素依賴型轉(zhuǎn)為生長因子依賴型。從而導(dǎo)致孕激素耐藥。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，不僅可以上調(diào)PR表達(dá)，也可以逆轉(zhuǎn)子

18、宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥。二甲雙胍通過降低循環(huán)IGF-1通路活性，抑制非經(jīng)典途徑PI3K/Akt，上調(diào)PR水平來恢復(fù)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對孕激素誘導(dǎo)的抑制增殖作用的敏感性，并激活能量感受器AMPK恢復(fù)細(xì)胞能量代謝，從而逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥。
　　本課題提出，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PR經(jīng)典途徑或非經(jīng)典途徑相互調(diào)控，利用抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的方法可逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥。子宮內(nèi)膜癌中存在“AMPK-IGF-1R-PR/PI3K/Akt”的