肺癌中PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)Skp2及其下游蛋白調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 肺癌是一種發(fā)病率、死亡率極高的惡性腫瘤。有資料顯示,2000年以來我國(guó)的肺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì),目前我國(guó)每年的肺癌死亡人數(shù)可達(dá)60萬(wàn),居所有惡性腫瘤之首[1]。腫瘤的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,多種信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生。其中,磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信號(hào)通路尤為受到關(guān)注,它可使Akt磷酸化,進(jìn)而激活或抑制其下游眾多靶蛋白,如Bad、Caspase9、N

2、F-κB、p21和p27等,從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,肺腫瘤細(xì)胞中PI3K信號(hào)通路活性異常增高,而阻斷PI3K通路,則可以抑制腫瘤的生長(zhǎng),這部分是由于阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程引起的。
　　 S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)是在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用的蛋白,它影響細(xì)胞的增殖與凋亡。Skp2最早是作為Cyclin-A-CDK2復(fù)合

3、物的一個(gè)組分被發(fā)王見[3],此后研究證明,Skp2也是F-box家族成員,為SCF(Skp1-Cullin-Skp2)型泛素蛋白連接酶的底物識(shí)別組分[4]。Skp2可調(diào)控細(xì)胞的G1/S期進(jìn)程,其分子機(jī)制是通過介導(dǎo)p21,p57,E2F1,MYC,CyclinA,Cyclin E,Cyclin D1和p27等細(xì)胞周期調(diào)控因子的泛素依賴性蛋白降解而實(shí)現(xiàn)的[5,6]。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物(Cyclin-dependent kinas

4、e inhibitor,CKI)p27是Skp2介導(dǎo)的主要降解底物,且只有p27的Thr-187位點(diǎn)磷酸化后才能被Skp2識(shí)別和泛素化降解[7]。Kei-Ichi等報(bào)道Skp2通過泛素化機(jī)制在S期與磷酸化CyclinE相連促其降解,這可能對(duì)細(xì)胞周期S期的有序發(fā)展及保持染色體核型的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[8]。
　　 研究表明,Skp2在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)升高,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),有癌蛋白特性,可作為腫瘤治療的

5、新靶點(diǎn)[9]。正是對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的泛素化降解是Skp2促進(jìn)G1向S期過渡和腫瘤發(fā)展的基礎(chǔ)。但肺癌中PI3K/Akt通路對(duì)Skp2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響卻不甚明了。本實(shí)驗(yàn)選取四種類型肺癌細(xì)胞系H460、LK2、H446和A549作為研究對(duì)象,探討肺癌中PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)Skp2蛋白的表達(dá)調(diào)控方式,及其對(duì)Skp2降解底物E2F1、p27、Cyclin E表達(dá)的影響,進(jìn)而揭示PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、

6、細(xì)胞周期調(diào)控的可能分子機(jī)制。
　　 方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng),LK2、A549細(xì)胞在含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液、HBE、H460和H446細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、在飽和濕度、在37℃、5％CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。
　　 2、細(xì)胞分組,將生長(zhǎng)至70％匯合度的細(xì)胞分組,處理組加入PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002(濃度25 μmol/L),對(duì)照組加入等體積DMSO,作用24

7、h后收集細(xì)胞。
　　 3、應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LY294002對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況,并繪制生長(zhǎng)曲線,篩選LY294002的最佳作用時(shí)間。
　　 4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H460、LK2、H446及A549四種細(xì)胞中對(duì)照組及處理組細(xì)胞周期變化。
　　 5、應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)H460、LK2、H446及A549四種細(xì)胞中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表達(dá)變化

8、。
　　 6、應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)H460、LK2、H446及A549四種細(xì)胞中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組Skp2、p27基因的表達(dá)差異。
　　 7、應(yīng)用免疫熒光法比較Skp2在肺正常細(xì)胞HBE及肺腫瘤細(xì)胞H460、LK2、H446及A549中的細(xì)胞定位差別,及LY294002處理后Skp2亞細(xì)胞定位變化。
　　 結(jié)果
　　 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化
　　 加入LY294002后,H446、A549

9、、LK2、H460細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢,在24 h時(shí)四種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到54.7±4.97％、55.7±3.24％、36.24％±4.56％和38.96％±3.17％。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程
　　 FCM結(jié)果顯示,H460、LK2、H446及A549四種細(xì)胞中,處理組的G1期細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加,而S期細(xì)胞則較對(duì)照組減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明處理組細(xì)胞阻滯于G1/S期。
　　 3、West

10、ern-blot法檢測(cè)Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表達(dá)
　　 與對(duì)照組相比,處理組Skp2蛋白在H460、LK2、H446及A549四種細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；p27在H446、A549細(xì)胞中表達(dá)增加,在H460、LK2中表達(dá)水平幾乎不變；Cyclin E在四種細(xì)胞中表達(dá)量增加:在H460、LK2、H446細(xì)胞中,E2F1蛋白表達(dá)量下降,H446中E2F1蛋白表達(dá)量顯著高于H460、LK2中

11、,而A549中E2F1蛋白未表達(dá)。
　　 4、實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)Skp2、p27基因的表達(dá)
　　 實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示,四種細(xì)胞中處理組Skp2基因表達(dá)均下降,而p27基因表達(dá)水平均升高。
　　 5、免疫熒光法檢測(cè)Skp2亞細(xì)胞定位
　　 在HBE、H460中Skp2蛋白主要定位于細(xì)胞核,LK2、H446、A549中Skp2蛋白部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；抑制劑處理后LK2、H446、A549中Skp2蛋白

12、部分向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,H460中核膜區(qū)及細(xì)胞質(zhì)中Skp2蛋白表達(dá)增加。
　　 結(jié)論
　　 1、H446、A549中存在Skp2-p27軸調(diào)控細(xì)胞周期,而在H460、LK2中下調(diào)Skp2,但未見p27增加,這兩種細(xì)胞系中p27并不是Skp2介導(dǎo)的降解底物。四種細(xì)胞系中E2F1、CyclinE均不為Skp2介導(dǎo)的降解底物。
　　 2、PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)Skp2轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)是通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1,但肺腺癌中并不通過