Toll樣受體2對(duì)小鼠過(guò)敏性炎癥及PI3K-Akt自噬信號(hào)通路的調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：
　　支氣管哮喘是目前最常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病之一,發(fā)病率和病死率近50年來(lái)仍然保持持續(xù)增加,已經(jīng)成為全球僅次于癌癥的第二大致死和致殘性疾病，其發(fā)病機(jī)制與體內(nèi)免疫異常有關(guān)。
　　Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是一組能夠識(shí)別病原微生物及細(xì)胞壁產(chǎn)物的跨膜蛋白質(zhì)，在固有免疫和獲得性免疫均有重要作用，在炎癥免疫中發(fā)揮樞紐作用。TLR2是重要的TLRs之一，有研究報(bào)道哮喘的發(fā)病機(jī)制與TL

2、R2有關(guān)。自噬是生物進(jìn)化過(guò)程中真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一種高度保守的細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象，與多種免疫和炎癥性疾病直接有關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的病理變化中包含有細(xì)胞自噬的異常，然而，具體機(jī)制并不十分清楚。哮喘發(fā)病機(jī)制中有關(guān)自噬涉及的細(xì)胞通路以及其調(diào)控等問(wèn)題研究較少。磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵酶之一。PI3K還是常見(jiàn)的細(xì)胞自噬通路中關(guān)鍵的分子之一，有關(guān)PI3K介導(dǎo)的自噬通路在哮喘中

3、的作用研究較少，其作用以及如何調(diào)控等尚待闡明。
　　本研究中，我們采用OVA致敏并激發(fā)小鼠使之產(chǎn)生過(guò)敏性炎癥，觀察小鼠肺內(nèi)炎癥的變化以及 TLR2在小鼠肺內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)使用 TLR2基因敲除小鼠，對(duì)PI3K信號(hào)通路相關(guān)的炎癥/自噬在過(guò)敏性炎癥發(fā)病機(jī)制中的作用以及 TLR2對(duì)該細(xì)胞通路的調(diào)控作用進(jìn)行了較深入的探討。
　　研究目的：
　　1、研究 TLR2在小鼠過(guò)敏性炎癥中的變化及其影響。
　　2、研究 TLR2對(duì)小

4、鼠肺組織PI3K/Akt信號(hào)通路自噬活化水平的影響。
　　研究方法：
　　1、過(guò)敏性炎癥動(dòng)物模型建立及肺內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
　　OVA吸入致敏并激發(fā)野生型C57BL/6雌性小鼠，21天后留取小鼠肺泡灌洗液，瑞氏染色法觀察炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)的變化，留取肺組織，采用H&E染色和PAS染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化; Western blot方法檢測(cè)肺組織勻漿TLR2水平的表達(dá)。
　　2、TLR2基因敲除對(duì)

5、小鼠過(guò)敏性炎癥及PI3K/Akt信號(hào)通路自噬活化水平影響
　　OVA致敏并激發(fā)TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠，留取小鼠肺灌洗液，瑞氏染色法比較兩組小鼠的炎癥細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)變化，ELISA法檢測(cè)比較IL-13、IFN-γ水平的變化。留取肺組織，HE染色和PAS染色法觀察比較兩組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥變化；Western blot方法檢測(cè)比較兩組小鼠肺內(nèi)MyD88、PI3K、P-Akt以及 Beclin-1和 LC3-II自噬蛋白表達(dá)

6、的變化。
　　3、靶向抑制自噬對(duì)野生型和TLR2基因敲除小鼠氣道過(guò)敏性炎癥及自噬活化水平的影響
　　給予小鼠OVA致敏和激發(fā)同時(shí)，予以自噬抑制劑3-MA處理。瑞氏染色法觀察兩組小鼠肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量和分類(lèi)的變化，ELISA方法檢測(cè)肺灌洗液IL-13、IFN-γ水平；留取肺組織，HE染色和PAS染色法觀察比較兩組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥變化；Western blot方法檢測(cè)比較兩組小鼠肺內(nèi)MyD88、PI3K、P-AKT以及

7、 Beclin-1和 LC3-II自噬蛋白表達(dá)的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1、OVA致敏并激發(fā)后小鼠肺內(nèi)炎癥以及TLR2蛋白表達(dá)水平的變化
　　OVA致敏并激發(fā)后的野生型小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥性變化，肺組織切片HE染色可見(jiàn)支氣管管壁明顯增厚，平滑肌增生，支氣管周?chē)⒀苤車(chē)胺伍g質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多；PAS染色可見(jiàn)小鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生明顯，氣管腔內(nèi)粘液的分泌程度明顯增多，部分呈粘液栓樣。肺灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)

8、顯著增高，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均明顯增高；與對(duì)照組小鼠相比，小鼠肺組織勻漿中 TLR2蛋白水平明顯增高。
　　2、TLR2基因敲除小鼠OVA致敏并激發(fā)后的肺內(nèi)炎癥減輕
　　與野生型小鼠相比較，OVA致敏并激發(fā)的TLR2-/-小鼠肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)、炎癥細(xì)胞數(shù)以及IL-13水平的增高程度較低，IFN-γ水平的下降程度也較弱。肺內(nèi)支氣管管壁增厚、支氣管周?chē)?、血管周?chē)胺伍g質(zhì)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕，

9、支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌的增多程度較輕；與野生型小鼠比較，肺內(nèi)炎癥程度有明顯的差異。
　　3、TLR2基因敲除小鼠肺內(nèi)PI3K/Akt自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯減弱
　　OVA致敏并激發(fā)的野生型小鼠肺組織中MyD88、PI3K、P-Akt、Beclin-1以及LC3-II蛋白的表達(dá)顯著增高，與之比較，TLR2基因敲除小鼠肺內(nèi)PI3K, P-Akt, Beclin-1和 LC3-II蛋白的表達(dá)也有明顯增高，但其增強(qiáng)程度明

10、顯弱于野生型小鼠，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、3-MA抑制OVA誘發(fā)的野生型小鼠肺部炎癥，而 TLR2基因敲除小鼠肺部炎癥沒(méi)有明顯改變
　　OVA致敏并激發(fā)同時(shí)使用自噬抑制劑3-MA處理的野生型小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和各炎癥細(xì)胞數(shù)量的增高受到明顯抑制，促炎因子IL-13水平的增高程度和抗炎因子IFN-γ水平降低程度有明顯減小；肺組織病理組織學(xué)顯示炎癥程度有明顯減輕。在OVA致敏并激發(fā)的TRL2基因敲除小鼠，同時(shí)使用

11、3-MA處理時(shí)，肺內(nèi)炎癥未有明顯降低。
　　5、3-MA抑制OVA誘導(dǎo)的野生型小鼠PI3K/Akt自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)，而TLR2基因敲除小鼠蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化
　　OVA致敏并激發(fā)的野生型小鼠，同時(shí)使用3-MA處理時(shí)，肺內(nèi)增高的PI3K、P-Akt以及 Beclin-1和 LC3-II自噬蛋白的表達(dá)程度有明顯降低。較高劑量的3-MA處理時(shí)上述變化更加顯著；提示3-MA能抑制PI3K信號(hào)通路的自噬，其作用與其濃度相關(guān)。而在O