LYN在急性B淋巴細(xì)胞白血病中對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　LYN是Src家族成員之一，是一種非受體蛋白酪氨酸激酶。除了T細(xì)胞以外，LYN基因在所有的血細(xì)胞中均有表達(dá)。最初LYN基因作為BCR信號(hào)通路的抑制劑被大家所熟知，但隨后的研究顯示LYN基因在多種細(xì)胞和信號(hào)通路中起不同的調(diào)節(jié)作用。PI3K-Akt信號(hào)通路可以通過(guò)多種類型的細(xì)胞刺激物激活，PI3K-Akt信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、存活和早期凋亡等。該信號(hào)通路受多種基因調(diào)控，如PTEN、SHIP等，

2、而有研究顯示，參與BCR信號(hào)通路的基因LYN基因在髓系白血病中參與調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路。我們前期實(shí)驗(yàn)，在急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1和B淋巴母細(xì)胞系HMy2中，通過(guò)用白血病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PU.1篩選差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)LYN基因在急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1中表達(dá)明顯增高。因此，我們考慮在急性B淋巴細(xì)胞白血病中，LYN基因?qū)I3K-Akt信號(hào)通路是否起調(diào)控作用及該信號(hào)通路對(duì)BALL-1細(xì)胞的增殖和早期凋亡的影響

3、。
　　目的：
　　1、在急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1中LYN對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路是否有調(diào)控作用
　　2、抑制PI3K-Akt信號(hào)通路后對(duì)在急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1細(xì)胞增殖和早期凋亡的影響。
　　方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　BALL-1細(xì)胞系培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液（含10％小牛血清），置于37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　二、siRNA干擾
　　溶解s

4、iRNA，用電轉(zhuǎn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，沉默LYN基因。
　　三、PI3K抑制劑LY294002
　　取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，次日加入LY294002，以相同體積的DMSO做對(duì)照。
　　四、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)
　　分別取干擾后及抑制后的細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR后，進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。
　　五、Western blot
　　分別收集干擾后及

5、抑制后細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　六、CCK8方法
　　取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染siRNA片段。轉(zhuǎn)染后，用CCK8方法檢測(cè)小干擾片段干擾LYN后對(duì)BALL-1細(xì)胞增殖的影響。另取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日加入抑制劑，以相同體積的DMSO做對(duì)照，CCK8方法檢測(cè)加入抑制劑后BALL-1細(xì)胞增殖情況。
　　七、流式
　　

6、取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染siRNA片段。轉(zhuǎn)染后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小干擾片段干擾LYN后對(duì)BALL-1細(xì)胞早期凋亡的影響。另取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日加入抑制劑，以相同體積的DMSO做對(duì)照，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入抑制劑后對(duì)BALL-1細(xì)胞早期凋亡的影響。
　　八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組變量之間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、。
　　結(jié)果：
　　1、LYN-siRNA轉(zhuǎn)染BALL-1細(xì)胞系后，LYN的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　2、LYN-siRNA轉(zhuǎn)染BALL-1細(xì)胞系后，Akt的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　3、LYN-siRNA轉(zhuǎn)染BALL-1細(xì)胞系后，細(xì)胞增殖數(shù)減少，細(xì)胞早期凋亡率增加。
　　4、在BALL-1細(xì)胞中加入PI3K抑制劑LY294002后，Akt的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平明顯降低