MiR-146a-Smad4信號(hào)途徑在急性非淋巴細(xì)胞性白血病中的作用.pdf

1、目的和意義：
　　以急性早幼粒白血病(APL)細(xì)胞株NB4作為急性髓性白血病體外研究的模型,篩選出和細(xì)胞增殖分化相關(guān)的microRNA。在明確在急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)細(xì)胞中有廣泛表達(dá)的基礎(chǔ)上,確定其調(diào)控的靶基因后進(jìn)行功能研究,并探討其和臨床預(yù)后相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　第一部分：
　　通過microRNA基因芯片檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化前后表達(dá)譜差異,找出和增殖分化潛在相關(guān)

2、的microRNA,并用teal-time PCR技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)。其中miR-146a在ATRA處理NB細(xì)胞后表達(dá)量逐漸降低,而其潛在靶基因Smad4蛋白的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。
　　第二部分：
　　利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建miR-146a表達(dá)質(zhì)粒,無關(guān)microRNA表達(dá)質(zhì)粒及含Smad4互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因重組質(zhì)粒,與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性,驗(yàn)證miR-146a和其潛在靶基因Smad4

3、之間的作用，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性明顯低于無關(guān)序列組和對(duì)照組。miR-146a可抑制Smad4的轉(zhuǎn)錄激活。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,在6種ANLL細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)形成miR-146a的過表達(dá)及抑制其表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證ANLL細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平對(duì)Smad4的基因表達(dá)無影響,過表達(dá)抑制蛋白的表達(dá)。
　　第三部分
　　利用計(jì)算機(jī)信息模型技術(shù)提出miR-146a上下游信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò),選取有融合基因表達(dá)的細(xì)胞株kas

4、umi-1和NB4細(xì)胞株,在不同的miR-146a表達(dá)的情況下,通過細(xì)胞形態(tài),增殖曲線和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)咆生物學(xué)行為的變化。結(jié)果顯示:抑制細(xì)胞內(nèi)miR-146a表達(dá),降低細(xì)胞增殖率,增加細(xì)胞的凋亡。
　　第四部分：
　　通過檢測(cè)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a的表達(dá),結(jié)合臨床資料,發(fā)現(xiàn):在ANLL患者中,APL患者miR-146的表達(dá)最高,M2型患者表達(dá)要高于M4,M5患者;miR-146a的表達(dá)和外周血白細(xì)胞數(shù)正相關(guān);