左旋丁苯酞對血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能的影響及對PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用.pdf

1、血管性癡呆(vasculardementia，VaD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征。VaD以學(xué)習(xí)、記憶功能損害為主要癥狀，可伴有運(yùn)動、語言、視空間及人格障礙。隨著社會人口日益老齡化和腦卒中后生存率的提高，由腦卒中造成的精神及智能損害日益突出，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。腦卒中后缺血-再灌注是誘發(fā)VaD的主要原因之一。
　　 腦缺血可以誘導(dǎo)腦梗死或選擇性腦神經(jīng)元死亡，當(dāng)缺血發(fā)生在與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)

2、的區(qū)域時，即可導(dǎo)致VaD的發(fā)生。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，同時又是缺血缺氧的敏感部位。但導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的調(diào)控機(jī)制目前不祥。細(xì)胞的死亡方式有2種:細(xì)胞壞死和程序性細(xì)胞死亡，其中程序性細(xì)胞死亡有Ⅱ型（細(xì)胞凋亡）和Ⅱ型（自噬性細(xì)胞死亡）兩種。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt，phosphoinositide3kinase/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個經(jīng)典抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它的激活在神經(jīng)細(xì)胞，尤其在缺血

3、缺氧神經(jīng)元損傷中起著重要作用，并逐漸受到廣泛重視。近年來發(fā)現(xiàn)其與自噬的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血和神經(jīng)退行性變中的作用已被廣泛研究，已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與學(xué)習(xí)認(rèn)知有關(guān)。但PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VaD發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。因此，研究PI3K/Akt信號通路與VaD的關(guān)系，對于VaD的基礎(chǔ)及臨床研究，具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 丁苯酞(3-n-butylphthalide，Na

4、P)是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制開發(fā)的一類新型抗腦缺血藥物，對急性缺血性腦卒中有明顯療效。既往研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有多靶點抗腦缺血作用，能改善缺血區(qū)局部腦血流，縮小腦梗死面積，改善線粒體功能，抑制自由基的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，抑制谷氨酸釋放，減輕腦缺血所致腦水腫，抗血栓形成和抗血小板聚集，并且有研究證實能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，神經(jīng)功能缺失及腦缺血記憶障礙。而這些機(jī)制均與血管性癡呆的發(fā)生有關(guān)。近年來，左旋丁苯酞(1

5、-NBP)和右旋丁苯酞(d-NBP)已經(jīng)被拆分，并且將拆分后的1-NBP和d-NBP進(jìn)行了對比研究后發(fā)現(xiàn)，1-NBP比d-NBP的作用更強(qiáng)，而且還發(fā)現(xiàn)在對神經(jīng)細(xì)胞凋亡研究中d-NBP的存在降低了dl-NBP的作用，從而證明d-NBP有拮抗1-NBP作用，因而開發(fā)1-NBP的意義更為重。目前該藥應(yīng)用于VaD的實驗研究少有報道，更無其與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間關(guān)系的報道?；诖耍疚臄M通過觀察PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VaD小鼠

6、海馬組織中的變化，以及1-NBP對VaD的影響，以探討PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VaD的發(fā)病機(jī)制中的作用及1-NBP的作用機(jī)制。
　　 第一部分:血管性癡呆小鼠模型的建立和左旋丁苯酞的防治作用
　　 目的:觀察腦反復(fù)缺血再灌注后C57BL/6小鼠行為學(xué)的改變和海馬病理學(xué)特征變化，并觀察1-NBP對腦反復(fù)缺血再灌注誘導(dǎo)的VaD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。
　　 方法:
　　 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為

7、假手術(shù)組（sham組）、模型組（IR組，造模后植物油灌胃6ml.kg-1.d-1，連續(xù)28天）、左旋丁苯酞預(yù)防性治療組（Pre-1-NBP組，造模前7天左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，連續(xù)7天）、左旋丁苯酞低劑量治療組（Low-1-NBP組，造模后左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，連續(xù)28天）和左旋丁苯酞高劑量治療組（High-1-NBP組，造模后左旋-丁苯酞灌胃60mg.kg-1.d-1，連續(xù)28天）;除假手術(shù)組

8、外均給予雙側(cè)頸總動脈反復(fù)三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，假手術(shù)組僅暴露頸總動脈不結(jié)扎。造模4周后通過Morris水迷宮試驗和跳臺試驗進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績測試，觀察其行為學(xué)改變;應(yīng)用琉堇染色觀察海馬病理學(xué)特征變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變——Morris水迷宮實驗
　　 在定位航行實驗中，IR組小鼠的尋臺潛伏期明顯長于Sham組小鼠[F(1，27)=30.09，p＜0.01]。1-NB

9、P各組小鼠尋臺潛伏期與IR組小鼠相比明顯縮短[F(3，50)=10.315，P＜0.01]。在實驗的第2-5天，sham組小鼠、Pre-1-NBP組小鼠尋臺潛伏期明顯短于IR組小鼠(P＜0.05，P＜0.01);在實驗的第3-5天，Low-1-NBP組和High-1-NBP組小鼠尋臺潛伏期明顯短于IR組小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 在空間探索試驗中，與IR組小鼠相比，Sham組小鼠對目標(biāo)象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0

10、.01)。與IR組小鼠相比，High-1-NBP和Pre-1-NBP組小鼠對目標(biāo)象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 2.被動逃避反應(yīng)的改變——跳臺實驗
　　 2.1下臺潛伏時間:IR組與Sham組相比小鼠的首次跳下平臺的潛伏時間明顯縮短(P＜0.01），提示小鼠記憶形成功能受損;Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組與IR組相比跳下平臺的潛伏時間明顯增加（P＜0.05）

11、，提示1-NBP可改善小鼠記憶形成功能。
　　 2.2錯誤次數(shù):IR組與Sham組相比小鼠跳下平臺的錯誤次數(shù)明顯增多(P＜0.05），Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組與IR組相比跳下平臺的錯誤次數(shù)明顯減少，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 3小鼠海馬的組織病理學(xué)改變
　　 硫堇染色顯示，sham組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊、致密，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰。I

12、R組小鼠海馬CA1區(qū)可見片段性的錐體細(xì)胞缺失，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，可見胞體縮小，形態(tài)不規(guī)則，呈梭型或多角形，胞核固縮、濃染，核仁模糊不清或消失。與IR組相比，Low-1-NBP組、High-1-NBP組和Pre-1-NBP組小鼠海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞缺失明顯減輕。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗通過雙側(cè)頸總動脈反復(fù)三次缺血-再灌注方法成功的建立了C57BL/6小鼠VaD模型。預(yù)防性和治療性應(yīng)用1-NBP可以減輕Va

13、D小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙，尤以預(yù)防性應(yīng)用1-NBP效果顯著。
　　 2.反復(fù)缺血再灌注4周后小鼠海馬組織CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞片段性缺失、排列紊亂、神經(jīng)元密度降低等改變。預(yù)防性和治療性應(yīng)用1-NBP可以減輕VaD小鼠海馬組織病理學(xué)變化，進(jìn)而改善其學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　 第二部分:PI3K激動劑及抑制劑對血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能的影響
　　 目的:觀察PI3K激動劑及抑制劑對VaD小鼠認(rèn)知功能的影響。
　　 方法:

14、將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、激動劑組(IR+IGF-1組，手術(shù)前及手術(shù)24小時后經(jīng)側(cè)腦室給予IGF-12ul/mouse)、激動劑溶劑對照組(IR+DW組，手術(shù)前及手術(shù)24小時后經(jīng)側(cè)腦室給予去離子水2μl/mouse)、抑制劑組(IR+LY294002組，手術(shù)前及手術(shù)24小時后經(jīng)側(cè)腦室給予LY29400210nmol/mouse)和抑制劑溶劑對照組(IR+DMSO組，手術(shù)前及手術(shù)24小時后經(jīng)側(cè)腦室給予同等體積(2

15、μl)的溶劑）;除假手術(shù)組外均給予雙側(cè)頸總動脈反復(fù)三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，側(cè)腦室插管給予相應(yīng)試劑;假手術(shù)組僅暴露頸總動脈不結(jié)扎。造模4周后通過Morris水迷宮試驗進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績測試，觀察其行為學(xué)改變;應(yīng)用WesternBlot方法測定各組小鼠海馬組織中Akt及p-AktSer473蛋白的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變——Morris水迷宮實驗
　　 在定位航行實驗中，

16、Sham組和IR+IGF-1組小鼠的尋臺潛伏期明顯短于IR+DW組、IR+LY294002組、IR+DMSO組小鼠[F(4，45)=9.702，P＜0.01]。
　　 在空間探索試驗中，與IR+DW組、IR+LY294002組、IR+DMSO組小鼠相比，sham組和IR+IGF-1組小鼠對目標(biāo)象限表現(xiàn)出明顯的偏愛(P＜0.01)。
　　 2.Akt、pAktSer473在海馬組織中表達(dá)的變化
　　 術(shù)后4周Sha

17、m組、IR+DW組、IR+IGF-1組、IR+DMSO組和IR+LY294002組之間Akt總蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);IR+DW組、IR+IGF-1組、IR+DMSO組和IR+LY294002組的p-AktSer473的蛋白表達(dá)明顯高于sham組（P＜0.01，P＜0.05）。IR+IGF-1組p-Akt的蛋白表達(dá)明顯高于IR+DW組、IR+DMSO組和IR+LY294002組（P＜0.05）。IR+LY294002組p-A

18、kt的蛋白表達(dá)低于IR+DMSO組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 PI3K激動劑IGF-1可以減輕VaD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，促進(jìn)海馬組織中p-AktSer473表達(dá)。其機(jī)制可能為IGF-1激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和自噬，從而改善VaD小鼠的認(rèn)知功能。
　　 第三部分:血管性癡呆小鼠海馬組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平變化及左旋丁苯酞的影響
　

19、　 目的:觀察血管性癡呆小鼠海馬組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平的變化及1-NBP的干預(yù)作用。
　　 方法:造模4周后采用Western-Blot方法測定各組小鼠海馬組織中Akt、p-AktSer473、mTOR和p-mTORSer2448蛋白的變化;采用免疫組化方法測定各組小鼠海馬組織中p-AktSer473蛋白的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.左旋丁苯酞對Akt、p-AktSer47

20、3蛋白表達(dá)的影響
　　 腦反復(fù)缺血再灌注術(shù)后4周各組之間Akt總蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）;與sham組相比，IR組、Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組p-AktSer473蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01);與IR組相比，Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組三組p-AktSer473的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 2.左旋丁苯酞對mTOR、p-

21、mTORSer2448蛋白的表達(dá)的影響:
　　 腦反復(fù)缺血再灌注術(shù)后4周各組之間mTOR總蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);IR組海馬組織p-mTORSer2448的蛋白明顯高于sham組(P＜0.01)。Pre-1-NBP組、Low-1-NBP組和High-1-NBP組三組海馬組織p-mTORSer2448的蛋白表達(dá)明顯高于IR組(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.腦反復(fù)缺血再灌注4周后

22、，VaD小鼠海馬組織中p-AktSer473、p-mTORSer2448的表達(dá)明顯增多。提示腦反復(fù)缺血再灌注使PI3K/Akt通路活化，Akt和mTOR活化可抵抗缺血引起的損傷，在神經(jīng)元的存活中發(fā)揮著重要的作用。
　　 2.左旋丁苯酞可促進(jìn)VaD小鼠海馬組織中p-AktSer473和p-mTORSer2448的表達(dá)。提示該藥可能通過激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)p-AktSer473和p-mTORSer2448的表達(dá)，從而發(fā)揮神

23、經(jīng)保護(hù)作用，改善小鼠認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)損害。
　　 第四部分:血管性癡呆小鼠海馬組織中自噬因子LC3B和Beclin1表達(dá)水平變化及左旋丁苯酞的影響
　　 目的:觀察血管性癡呆小鼠海馬組織中LC3B和Beclin1蛋白及mRNA表達(dá)的變化及1-NBP的干預(yù)作用。
　　 方法:造模4周后應(yīng)用WesternBlot方法測定各組小鼠海馬組織中LC3B蛋白表達(dá)的變化，應(yīng)用FQRT-PCR方法測定各組小鼠海馬LC3B和Be

24、clin1mRNA表達(dá)的變化
　　 結(jié)果:
　　 1.LC3B蛋白的表達(dá)情況:
　　 術(shù)后4周IR組海馬組織LC3B蛋白表達(dá)明顯高于sham組、Pre-1-NBP組和High-1-NBP組（P＜0.01）。
　　 2.LC3B、Beclin1的mRNA表達(dá)水平
　　 IR組小鼠海馬LC3BmRNA和Beclin1mRNA的表達(dá)比Sham組明顯增加（P＜0.05）;Pre-1-NBP組、Low-1-

25、NBP組和High-1-NBP組三組海馬組織中LC3BmRNA和Beclin1mRNA的表達(dá)無組間差異(P＞0.05)，與Sham組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但較IR組明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.腦反復(fù)缺血再灌注4周后，小鼠海馬組織LC3B蛋白、LC3BmRNA和Beclin1mRNA表達(dá)均顯著升高，與小鼠行為學(xué)改變和神經(jīng)元損傷基本一致。
　　 2.左旋丁苯酞降低小鼠

26、海馬組織LC3B蛋白、LC3BmRNA和Beclin1mRNA表達(dá)（與其上游抑制物p-mTOR的表達(dá)相反）。提示1-NBP可能通過激活PI3K/Akt通路抑制自噬，從而減少VaD小鼠海馬神經(jīng)元損傷，減輕認(rèn)知功能障礙。
　　 第五部分:血管性癡呆小鼠側(cè)腦室室管膜掃描電鏡的變化特征及左旋丁苯酞的影響
　　 目的:觀察VaD小鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和室管膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，以及1-NBP的影響。
　　 方法:通過掃描

27、電鏡觀察造模4周后sham組、IR組和High-1-NBP組小鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和室管膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點
　　 Sham組側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞細(xì)胞胞體形狀規(guī)則，細(xì)胞之間界限清晰，微絨毛密布上皮細(xì)胞游離面，較粗短，細(xì)胞表面可見大小不一的分泌泡。IR組小鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞形狀變得極不規(guī)則，有的細(xì)胞有突起，有的呈溝回樣皺縮，有的細(xì)胞表面光滑，并可

28、見大量的分泌泡，分泌物增多，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞表面呈泥沙樣堆積，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞上微絨毛明顯減少甚至消失。High-1-NBP組小鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞排列尚規(guī)律，細(xì)胞間界限較清晰。
　　 2.小鼠側(cè)腦室室管膜表面超微結(jié)構(gòu)特點
　　 sham組小鼠可見室管膜上皮細(xì)胞表面帶有大量的纖毛和微絨毛，纖毛，粗細(xì)較為均勻，在纖毛的空隙處，分布著眾多的微絨毛。IR組小鼠室管膜上皮細(xì)胞表面可見纖毛稀疏、倒伏，部分粘附呈縷。部分纖毛表面