SDF-1對糖尿病外周血EPCs功能影響及PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究.pdf

1、目的:
　　1、觀察基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)對糖尿病外周血內(nèi)皮祖細胞(EPCs)功能的影響。
　　2、探討SDF-1對EPCs的影響是否與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。
　　方法:
　　1、10例健康人為健康對照組（HC組），20例糖尿病患者為DM組，均采集空腹外周靜脈血各20ml，肝素抗凝，密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞，EGM-2MV培養(yǎng)基（含5％FBS）培養(yǎng)4天后，吸棄上清液，用0.25％胰蛋

2、白酶消化貼壁EPCs，倒置熒光顯微鏡鑒定DiI-ac LDL和FITC-UEA-1雙染色陽性者為正在分化的EPCs，流式細胞儀檢測其表面標(biāo)志(CD34、CD133及KDR)進一步鑒定EPCs。非干預(yù)組(HC2組及DM2組)上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，干預(yù)組(HC1組及DM1組)在上述基礎(chǔ)上加入濃度為100ng/ml SDF-1培養(yǎng)至第7天。培養(yǎng)7天后，收集EPCs，然后分別采用改良的Boyden小室和體外血管生成試劑盒分別觀察EPCs的遷移和

3、體外血管生成能力。
　　2、采集1例健康人和1例糖尿病患者空腹外周靜脈血各20ml，EPCs的分離、培養(yǎng)同前，細胞培養(yǎng)至第四天進行換液，6孔依次為空白對照、1 ng/ml SDF-1、10ng/mlSDF-1、100ng/ml SDF-1、單純AMD3100及100ng/mlSDF-1+AMD3100,培養(yǎng)至第七天。吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，將貼壁細胞刮下，沉淀離心后加入細胞裂解液，重懸后冰浴離心，收集上清液，煮沸后高速離心1m

4、in，即可進行SDS-PAGE電泳，最終進行蛋白印記分析。
　　結(jié)果:
　　1、DM2組的EPCs趨化遷移能力和血管形成能力明顯低于HC2組（分別為15.50±2.224 vs22.20±1.304 and113.87±15.198 vs181.80±9.202），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。與HC2組比較，HC1組的EPCs趨化遷移能力(24.60±1.517 vs22.20±1.304)和血管形成能力（197.9

5、8±10.855 vs181.80±9.202）增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與DM2組比較，DM1組的EPCs趨化遷移能力（19.30±1.337 vs15.50±2.224）和血管形成能力（140.52±10.622 vs113.87±15.198）明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。
　　2、用Western blot法分別檢測兩組人群EPCs中AKT蛋白的表達水平:對于HC組，AKT蛋白的表達在空白對照

6、組和1ng/mlSDF-1組（0.83±0.008 vs0.84±0.004）差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);10ng/mlSDF-1組AKT蛋白的表達較空白對照組（0.87±0.005 vs0.83±0.008）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);100ng/mlSDF-1組AKT蛋白的表達較空白對照組（0.90±0.009 vs0.83±0.008）明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001);單純AMD3100組AKT蛋白的表

7、達較空白對照組（0.75±0.014 vs0.83±0.008）低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001);100ng/mlSDF-1+AMD3100組AKT蛋白的表達較100ng/mlSDF-1組（0.64±0.023vs0.90±0.009）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。對于DM組，AKT蛋白的表達在空白對照組、1 ng/mlSDF-1組、10ng/mlSDF-1組、100ng/mlSDF-1組的表達呈遞增的趨勢（分別為

8、:0.71±0.011 vs0.74±0.012 vs0.79±0.007 vs0.84±0.012），1ng/mlSDF-1組與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，10ng/mlSDF-1組及100ng/mlSDF-1組與空白對照組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.001);單純AMD3100組AKT蛋白的表達較空白對照組（0.63±0.008 vs0.71±0.011）低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001);100ng/mlSDF