二黃糖腎康對糖尿病腎病大鼠腎臟細胞凋亡及PI3K-AKT信號轉導系統(tǒng)的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(dia-betesreellitus,DM)代謝異常引起的腎小球硬化癥,是DM常見的嚴重慢性微血管并發(fā)癥,最終發(fā)展為腎衰竭。DN引發(fā)的終末期腎功能衰竭(ESRD)正在成為威脅糖尿病患者生命的主要因為。據(jù)美國2000年統(tǒng)計,每年新增ESRD患者中由DN引發(fā)的已近50％[2]。近幾年在我國經(jīng)濟較發(fā)達地區(qū)統(tǒng)計資料也發(fā)現(xiàn)DN所致ESRD的比例達15％[2],因此,有效控

2、制DN的發(fā)病率和疾病的進展是當前醫(yī)學界重要的課題。現(xiàn)代醫(yī)學在控制血糖、血壓等基礎治療方面取得了很大的進展,但在腎病治療方面尚無特殊進展。
　　 DN的基本病理特征早期表現(xiàn)為腎小球高濾過、腎小球肥大,晚期表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)細胞外基質(ECM)增生、腎小管間質纖維化,最終導致腎小球硬化、腎功能衰竭。近些年來,隨著分子生物學技術的不斷進步,細胞凋亡(apoptosis,APO)研究的深入,證實細胞凋亡參與了多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及修

3、復過程。尤其在糖尿病腎病晚期,腎小球的細胞凋亡與腎功能惡化密切相關。在細胞凋亡過程中最關鍵的途徑是由caspase家族激活而引導的細胞凋亡。其中caspase-3和caspase-9是該家族中最重要的兩個成員。Caspase-3是細胞凋亡過程中的執(zhí)行分子,可以剪切細胞凋亡過程中的許多關鍵蛋白；而caspase-9現(xiàn)被證明是凋亡過程中重要的啟動因子。
　　 中西醫(yī)結合學院腎病研究室依據(jù)中醫(yī)“脾氣散精”、“腎主封藏”和“久病入絡”的

4、理論,采用益氣扶正、補脾益腎、活血通絡、解毒降濁的二黃糖腎康(黃芪、大黃、黨參、茯苓、水蛭、鬼箭羽、桑寄生等)治療本病,取得了較好的療效。本實驗采用切除右側腎臟加腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)的方法復制DN大鼠模型,觀察二黃糖腎康對腎臟細胞凋亡率,調(diào)控蛋白caspase-3、caspase-9的蛋白表達,及對PI3 K/AKT信號轉導系統(tǒng)的影響。探討二黃糖腎康對糖尿病腎病的作用機制為臨床治療DN提供科學的實驗依據(jù)。
　　 方法:選

5、用清潔級雄性健康SD大鼠60只,隨機抽10只為假手術組(sham-operation group,SO),其余50只行右腎切除術,2周后傷口愈合,按50mg·kg腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ),48h后尾尖取血,測定血糖。血糖≥16.7mmol·L為成模。將成模大鼠隨機分為:模型組(model group,M)、二黃糖腎康高劑量組(high-dose Yushenheji group,H)、二黃糖腎康低劑量組(Low-dose Yushe

6、nheji group,L)、貝那普利組(Benazepril group,B),每組10只。EL組、EH組和B組均于上午給予糖適平5mg/kg體重。下午B組給予貝那普利1.7mg/kg體重；EL組給予二黃糖腎康口服液0.5mL/100g體重(相當于成人的10倍)；EH組給予二黃糖腎康1mL/100g體重(相當于成人的20倍)。本實驗共8周,實驗期間動物自由進食、飲水,不使用胰島素及其他降糖藥物。第8周最后一次給藥后,禁食8小時,斷頭處

7、死,無菌操作取左腎,去掉腎臟包膜,取部分皮質置于70％酒精中固定,用于流式細胞術檢測；將剩余部分的腎皮質置于液氮中凍存后轉至-70℃存放,以備用檢測Westernblot,測定信號蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1二黃糖腎康對DN大鼠KW/BW的影響
　　 M組(6.81±0.51)高于SO組(3.36±0.68),兩組比較有顯著性差異(p<0.01)。各治療組與M組相比明顯下降(p<0.05,p<0.01),

8、有顯著差異。B組(4.80±0.83)同H組(4.67±0.70)比較無顯著性差異(p>0.05)；H組明顯低于L組(6.17±0.55),兩組比較有顯著性差異(p<0.01)。
　　 2二黃糖腎康對腎臟細胞凋亡率的影響
　　 SO組(4.17±0.77)；H組(5.24±0.44)比B組(7.58±1.08)明顯減少(p<0.05)；H組與L(6.34±0.95)組比較,有減少趨勢,但無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。各治

9、療組比M(13.98±1.74)組均明顯減少(p<0.01)；
　　 3二黃糖腎康對腎臟細胞caspase-9、caspase-3蛋白表達的影響
　　 各治療組與M組caspase-9(1.35±0.02)、caspase-3(1.38±0.01)比較發(fā)現(xiàn)EL組caspase-9(1.22±0.02)、caspase-3(1.28±0.01)；EH組caspase-9(1.08±0.01)、caspase-3(1.10±

10、0.01)；B組caspase-9(1.31±0.01)、caspase-3(1.34±0.02),均有明顯差異(p<0.01或P<0.05)。EL組、EH組與B組比較,亦有明顯差異(p<0.05,P<0.01)；EL組與EH組相比,有明顯差異(p<0.01)。
　　 4二黃糖腎康對腎臟細胞信號蛋白表達的影響
　　 利用圖片掃描儀分析結果顯示,各組Akt的表達水平無顯著差異。B組、EL組、EH組在P—Akt表達水平上與M