苦瓜蛋白對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa H細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞內(nèi)PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的： 研究苦瓜蛋白對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa H細(xì)胞體外增殖、凋亡及對細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以探討苦瓜蛋白體外抗子宮內(nèi)膜癌作用機(jī)制和應(yīng)用價(jià)值，以期為子宮內(nèi)膜癌的中醫(yī)藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.苦瓜蛋白的提取及鑒定。 2.體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa H細(xì)胞，用不同濃度的苦瓜蛋白(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/

2、ml)進(jìn)行干預(yù)，設(shè)立空白對照組，應(yīng)用細(xì)胞活性計(jì)數(shù)方法(Cell Counting Kit-8，CCK-8法)檢測不同濃度苦瓜蛋白作用不同時間(24小時、48小時、72小時)對Ishikawa H細(xì)胞體外生長的影響。 3.倒置顯微鏡下觀察Ishikawa H細(xì)胞經(jīng)苦瓜蛋白作用引起的形態(tài)學(xué)變化。 4.流式細(xì)胞儀測定不同濃度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用48小時、72小時對Ishi

3、kawa H細(xì)胞周期分布的影響。 5.采用瓊脂糖DNA凝膠電泳檢測不同濃度的苦瓜蛋白(0μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)對Ishikawa H細(xì)胞作用72小時后的凋亡DNA，同時采用Annexin V-FITC法和TUNEL法檢測20μg/ml苦瓜蛋白作用72小時對Ishikawa H細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率的影響。 6.采用蛋白免疫印跡法(

4、Western blot)檢測不同濃度苦瓜蛋白(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用72小時和20μg/ml的苦瓜蛋白作用不同時間(0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h)對Ishikawa H細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylation AKT，P-AKT)、蛋白激酶B(protein kianse B，AKT)表達(dá)量的影響，同時設(shè)立空白對照組(不加

5、苦瓜蛋白)和陽性對照組(1μmol/l PI3K抑制劑wortmannin作用1小時)。 結(jié)果： 1.苦瓜籽經(jīng)丙酮梯度沉淀得到的苦瓜籽粗蛋白，經(jīng)假配基親和層析后濃縮得到了部分純化的中間提取物，將此中間提取物通過葡聚糖凝膠G-75凝膠層析柱，利用分子排阻的原理將不同分子量的蛋白分開。經(jīng)凝膠層析后得到了4個較為明顯的吸收峰，取各個峰及其總蛋白峰洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，并用考馬斯亮藍(lán)G-250染色得到了一條分子量約為30K

6、D的條帶。無細(xì)胞系統(tǒng)中峰4對蛋白質(zhì)生物合成抑制活性測定：IC50=5.3×10-10mol/L。 2.CCK-8法檢測苦瓜蛋白對Ishikawa H細(xì)胞體外生長的影響結(jié)果： (1)20μg/ml的苦瓜蛋白作用24小時、48小時、72小時后細(xì)胞生長抑制率分別為37.93％，55.90％，81.58％。 (2)不同的濃度(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml

7、)作用72小時后細(xì)胞生長抑制率分別為31.04％，39.46％，40.26％，58.84％，77.85％，81.58％。利用曲線擬合計(jì)算在72小時，苦瓜蛋白對Ishikawa H細(xì)胞生長的IC50為1.86μg/ml。 可見，隨著作用時間延長和濃度的增加，苦瓜蛋白對細(xì)胞的生長抑制率也增大，時間和濃度有交互作用(F=15.949，P<0.01)，20μg/ml苦瓜蛋白作用72小時對細(xì)胞的生長抑制率最大。 3.倒置顯微鏡下可

8、見經(jīng)苦瓜蛋白作用后Ishikawa H細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，數(shù)量減少，有部分細(xì)胞皺縮變小，顆粒增多，并可見細(xì)胞碎片。 4.流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期分布測定結(jié)果： (1)不同濃度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用Ishikawa H細(xì)胞48小時后G1/G0期細(xì)胞比例逐漸減少(F=106.866，P<0.01)，而S期細(xì)胞比例逐漸增加(F=99.686，P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例無明

9、顯變化(F=2.223，P=0.163)。不同濃度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用Ishikawa H細(xì)胞72d，時，G1/G0期細(xì)胞所占比例減少(F=238.272，P<0.01)，S期細(xì)胞所占比例增加(F=742.190，P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化(F=2.221，P=0.153)。 (2)20μg/ml的苦瓜蛋白作用Ishikawa H細(xì)胞72d，時較作用48d

10、，時對細(xì)胞周期影響更顯著，G0/G1期比例減少(t=13.393，P<0.01)，S期細(xì)胞比例增加(t=6.862，P<0.01))G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化(t=1.716，P=0.161)。 所以，苦瓜蛋白能使Ishikawa H細(xì)胞阻滯于S期，S期細(xì)胞比例增多和G0/G1期比例減少呈明顯的時間和濃度依賴性，對S期細(xì)胞增多和對G1/G0期細(xì)胞減少的作用，時間和濃度存在交互作用(F=13.612，P<0.01；F=21.78

11、6，P<0.01)，且在20μg/ml苦瓜蛋白作用72d，時，S期細(xì)胞增多和G1/G0細(xì)胞減少作用最顯著。 5.不同濃度的苦瓜蛋白(0μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)對Ishikawa H細(xì)胞作用72小時，瓊脂糖DNA凝膠電泳可見階梯狀凋亡DNAladder。 6.Annexin V-FITC法和TUNEL法測定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示20μg/ml的

12、苦瓜蛋白作用Ishikawa H細(xì)胞72小時的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為16.07±0.15％，17.58±0.60％，提示苦瓜蛋白能誘導(dǎo)Ishikawa H細(xì)胞發(fā)生凋亡。 7.Western blot結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜癌Ishikawa H細(xì)胞為PTEN基因表達(dá)缺失的細(xì)胞株，不同濃度的苦瓜蛋白作用Ishikawa H細(xì)胞72小時P-AKT/AKT的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=975.995，P<0.01)。隨著濃度的增加，P

13、-AKT/AKT的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，且在10μg/ml、20μg/ml的苦瓜蛋白處理后引起P-AKT/AKT的下調(diào)作用與陽性對照PI3K抑制劑wortmannin作用相當(dāng)。20μg/ml的苦瓜蛋白作用Ishikawa H細(xì)胞不同時間P-AKT/AKT的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.582，P<0.01)，隨著作用時間的延長，P-AKT/AKT的表達(dá)量呈逐漸減少的趨勢，在12小時時抑制作用已達(dá)到最強(qiáng)。 結(jié)論： 1

14、.經(jīng)假配基親和層析和凝膠過濾層析相結(jié)合的純化的方法可以得到較高純度的苦瓜核糖體失活蛋白。 2.子宮內(nèi)膜癌Ishikawa H細(xì)胞經(jīng)苦瓜蛋白處理后，細(xì)胞生長受到抑制，隨著時間延長和濃度增加，細(xì)胞生長抑制率增大。 3.苦瓜蛋白能誘導(dǎo)Ishikawa H細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 4.苦瓜蛋白使Ishikawa H細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，阻滯于S期，表現(xiàn)為S期細(xì)胞增多，G1/G0期細(xì)胞減少。 5.苦瓜蛋白抑制Ishikaw