尼古丁通過PI3K-Akt信號通路保護大鼠軟骨細胞抵抗白介素-1誘導的細胞凋亡.pdf

1、目的:探索尼古丁對IL-1β誘導的大鼠OA軟骨細胞(模擬OA軟骨細胞)的調(diào)節(jié)作用,觀察是否能夠通過激活軟骨細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路而抑制OA軟骨細胞調(diào)亡、維持其存活;同時結(jié)合大鼠OA動物模型檢測尼古丁對OA軟骨組織損傷的影響,為將來臨床上應用尼古丁預防與治療OA的可能機制提供理論依據(jù)。
　　 方法:體外實驗:(1)軟骨細胞分離培養(yǎng):從新生大鼠關(guān)節(jié)軟骨中分離出軟骨細胞,使用特殊染色及免疫組化對其進行鑒定,并使其與軟骨細胞凋亡

2、誘導調(diào)節(jié)劑IL-1β(10ng/ml)共培養(yǎng)2小時,模擬體外OA軟骨細胞。(2)軟骨細胞生存能力檢測:經(jīng)尼古丁處理后,四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)檢測軟骨細胞活性。(3)軟骨細胞凋亡率檢測:采用流式細胞儀熒光素碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)單標法檢測軟骨細胞晚期凋亡率。(4)PI3K/Akt通路及相關(guān)信號分子的檢測:蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測Akt,p-Akt及其下游信號分子b

3、cl-xl、bcl-2和p70S6,核糖體S6激酶的蛋白分泌水平;反轉(zhuǎn)錄RCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測Akt1-mRNA的表達水平。體內(nèi)試驗:(1)大鼠膝關(guān)節(jié)動物模型建立:通過右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除+內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)構(gòu)建大鼠骨性關(guān)節(jié)炎(OA)模型。(2)尼古丁對大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨作用觀察:關(guān)節(jié)腔注射尼古丁,組織學與免疫組化技術(shù)評估大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)

4、結(jié)構(gòu)變化及與PI3K/Akt信號通路相互關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)體外實驗:經(jīng)分離的細胞甲苯胺藍著色胞漿染成淺藍色,可見1-3個核仁,呈紫藍色;細胞周圍亦有少量異染顆粒出現(xiàn),Ⅱ型膠原呈強陽性表達,細胞漿內(nèi)有黃染顆粒,胞核基本無著色;尼古丁可刺激由IL-1β誘導的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的活性而抑制其凋亡。對大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞處以尼古丁可上調(diào)p-Akt蛋白表達水平,但卻未能提高Akt1-mRNA的表達水平。進一步的實驗檢測到尼古

5、丁可增強部分Akt下游分子:p70S6、核糖體S6激酶、bcl-xl、bcl-2、TMP-1的表達,但是卻抑制了MMP-13的表達。(2)體內(nèi)試驗:大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腔注射尼古丁促進損傷軟骨表面的修復,增加了表面軟骨的厚度,同時提高了p-Akt的蛋白表達。
　　 結(jié)論:尼古丁可部分通過激活PI3K/Akt信號通路保護由IL-1β誘導的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型軟骨細胞的細胞凋亡;同時減緩骨性關(guān)節(jié)炎導致的關(guān)節(jié)軟骨組織的損傷。為此,尼古丁通