糖皮質(zhì)激素通過PI3K-Akt細胞信號傳導通路誘導內(nèi)皮祖細胞功能失調(diào).pdf

1、目的:糖皮質(zhì)激素的應用是引起非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的重要危險因素,而非 C創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死患者往往伴隨著內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能的改變,明確糖皮質(zhì)激素對內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能的影響及其作用機制,對疾病的預防和早期治療具有重要的意義。
　　方法:(1)密度梯度離心法分離新生兒臍帶血單個核細胞并培養(yǎng)于 EGM-2培養(yǎng)基中,通過形態(tài)學觀察、結(jié)合 FITC-標記荊豆凝集素-1和吞噬 DiL-標記乙?；兔芏戎鞍纂p染實驗、量子點免疫熒光

2、技術(shù)檢測內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的蛋白表達以及體外小管形成能力對內(nèi)皮祖細胞進行鑒定;(2)采用不同濃度地塞米松干預內(nèi)皮祖細胞, CCK-8和EdU試劑盒檢測細胞增殖能力、Transwell小室檢測細胞遷移能力、小管形成實驗檢測細胞體外小管形成能力、一氧化氮檢測試劑盒檢測一氧化氮生成濃度;(3)分別使用MAPK/ERK細胞信號通路特異性抑制劑 PD98059和PI3K特異性抑制劑LY294002和Wortmannin預先干預內(nèi)皮祖細胞,Wes

3、tern blotting和實時定量 RT-PCR檢測糖皮質(zhì)激素對內(nèi)皮祖細胞 Akt和eNOS的表達的影響。
　　結(jié)果:(1)臍帶血分離的單個核細胞在 EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,呈典型的克隆樣生長,特異性結(jié)合 FITC-標記荊豆凝集素-1并吞噬 DiL-標記乙?；兔芏戎鞍?分泌內(nèi)皮型一氧化氮合成酶并能在體外形成小管樣結(jié)構(gòu),證實培養(yǎng)的細胞為內(nèi)皮祖細胞;(2)短時間應用糖皮質(zhì)激素,可以抑制內(nèi)皮祖細胞增殖、遷移、體外小管形成和生成

4、一氧化氮的能力,并且呈現(xiàn)濃度依賴性;(3)PI3K特異性抑制劑 LY294002和Wortmannin能夠進一步抑制糖皮質(zhì)激素抑制內(nèi)皮祖細胞 Akt磷酸化和eNOS的表達,而MAPK/ERK細胞信號通路特異性抑制劑 PD98059則無明顯作用。
　　結(jié)論:(1)臍帶血分離的單個核細胞在 EGM-2培養(yǎng)基中,可以增殖、分化為內(nèi)皮祖細胞;(2)短時間應用糖皮質(zhì)激素,可以抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖、遷移、小管形成和生成一氧化氮的能力,并且呈濃

5、度依賴性;(3)PI3K/Akt細胞信號通路參與介導糖皮質(zhì)激素對內(nèi)皮祖細胞的抑制作用。
　　主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 臍帶血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的:從新生兒臍帶血中分離、培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞并對其進行鑒定。
　　方法:密度梯度離心法分離新生兒臍帶血單個核細胞并培養(yǎng)于 EGM-2培養(yǎng)基中,通過形態(tài)學觀察、結(jié)合 FITC-標記荊豆凝集素-1和吞噬 DiL-標記乙?；兔芏戎鞍纂p染實驗、量

6、子點免疫熒光技術(shù)檢測內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的蛋白表達以及體外小管形成能力對內(nèi)皮祖細胞進行鑒定。
　　結(jié)果:培養(yǎng)的細胞能形成典型的克隆樣生長,特異性結(jié)合 FITC-標記荊豆凝集素-1和吞噬 DiL-標記乙?；兔芏戎鞍?能夠合成并分泌內(nèi)皮型一氧化氮合成酶,在體外形成小管樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:密度梯度離心分離臍帶血單個核細胞,在體外培養(yǎng),可以增殖、分化為內(nèi)皮祖細胞。
　　第二部分 糖皮質(zhì)激素對內(nèi)皮祖細胞功能的影響
　　

7、目的:探討糖皮質(zhì)激素對內(nèi)皮祖細胞增殖、遷移、小管形成和一氧化氮生成的影響。
　　方法:采用不同濃度地塞米松干預內(nèi)皮祖細胞,CCK-8和EdU試劑盒檢測細胞增殖能力、Transwell小室檢測細胞遷移能力、小管形成實驗檢測細胞體外小管形成能力、一氧化氮檢測試劑盒檢測一氧化氮生成濃度。
　　結(jié)果:短時間應用糖皮質(zhì)激素,可以抑制內(nèi)皮祖細胞增殖、遷移、體外小管形成和生成一氧化氮的能力,并且呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結(jié)論:糖皮質(zhì)激素