PI3K-Akt信號通路對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B基因表達的調(diào)控及其分子機制研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)廣泛而顯著的表觀遺傳學(xué)變化，包括DNA甲基化和染色質(zhì)修飾。DNA甲基化是最廣為人知的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA(cytosine-5)-methyltransferases，DNMTs)(EC2.1.1.37)所控制。目前，已鑒定的人類具有催化活性的DNMTs有三種：DNMTl，DNMT3A和DNMT3B，其編碼基因分別位于染色體19p13.2.、2p23和20q11.2。DNMT1優(yōu)先選擇D

2、NA復(fù)制過程中所形成以半甲基化狀態(tài)存在的DNA雙鏈作為催化底物，而DNMT3A和DNMT3B是從頭(de novo)DNA甲基化修飾所必須的，主要為在細(xì)胞內(nèi)建立新DNA甲基化類型所必須。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在異常DNA甲基化類型，即廣泛的DNA低甲基化與某些基因啟動子特異高甲基化。發(fā)生在啟動子CpG島高甲基化可影響許多與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因的表達，在惡性腫瘤以及在癌旁組織向惡性狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中均發(fā)現(xiàn)DNMTs升高。有學(xué)者認(rèn)為具有

3、從頭DNA甲基化作用的DNMT3B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有更重要作用。在細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路調(diào)控眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如細(xì)胞生長與存活、細(xì)胞間信息傳遞等。異常PI3K/Akt信號通路參與腫瘤形成與轉(zhuǎn)移。我們實驗室已報道PI3K/Akt信號通路可以維持DNMT1蛋白穩(wěn)定性，從而在腫瘤發(fā)生中起促進作用，但PI3K/Akt信號通路對DNMT3B基因表達影響及調(diào)控尚未見報道。
　　在本文第一部分實驗中，我們在6株人肝癌(Human h

4、epatocellular carcinoma，HCC)細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)DNMT3B mRNA表達水平與Akt1 mRNA或Akt2 mRNA表達水平相關(guān)；不同HCC細(xì)胞株的DNMT3B3mRNA水平與DNMT3B4 mRNA水平比值有較大的差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)人肝癌組織中DNMT3B基因表達明顯高于其相對應(yīng)癌旁組織。
　　為了探討Akt是否參與DNMT3B基因調(diào)控，在第二部分實驗中，我們首先檢測Akt作為上游調(diào)節(jié)劑及增量調(diào)節(jié)劑的PI

5、3K對DNMT3B基因影響，研究發(fā)現(xiàn)PI3K的小分子特異性抑制劑LY294002在BEL-7404細(xì)胞株中下調(diào)DNMT3BmRNA和蛋白質(zhì)水平且呈劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。我們觀察到LY294002對DNMT3BmRNA表達的下調(diào)降低程度在各個時間點均高于其對DNMT3B蛋白的下調(diào)程度，提示LY294002對DNMT3B基因下調(diào)可能存在著轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)LY294002誘導(dǎo)DNMT3B基因表達下調(diào)并不伴隨DNMT3B亞

6、細(xì)胞定位變化。在SMCC7721細(xì)胞株及L02細(xì)胞株均觀察到LY294002降低DNMT3B基因表達。接著我們還應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX來檢測LY294002對DNMT3B基因表達下調(diào)是否與蛋白質(zhì)從頭機器抑制相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY294002不影響DNMT3B蛋白的穩(wěn)定性。在第二部分實驗中，我們還利用本實驗室已經(jīng)建立的持續(xù)性活化Akt2的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ak

7、t1/2shRNA的BEL-7404細(xì)胞株去研究Akt對DNMT3B基因調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)Akt2持續(xù)性活化導(dǎo)致DNMT3BmRNA及蛋白質(zhì)水平升高，而在BEL-7404細(xì)胞中敲低Akt1/2引起DNMT3BmRNA及蛋白質(zhì)水平均降低。再者，我們觀察到Akt下游信息分子糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑氯化鋰可促進DNMT3B基因表達中度增加。以上實驗結(jié)果表明DNMT3B基因表達

8、受到PI3K/Akt信號通路的調(diào)控。
　　為了深入闡明PI3K/Akt信號通路調(diào)控DNMT3B基因表達的分子機制，在第三部分實驗中，我們研究了LY294002對DNMT3B啟動子活性的影響。首先我們依據(jù)Yanagisawa報道，構(gòu)建了四個不同長度DNMT3B啟動子片段，包括核心啟動子序列及基本啟動子序列，并將它們克隆到pGL3-Basic熒光素酶報告基因上游，經(jīng)測序比對正確后，選擇構(gòu)建成功載體進行下一步試驗。我們通過瞬時轉(zhuǎn)染方法及

9、雙熒光素酶檢測系統(tǒng)研究啟動子質(zhì)粒在BEL-7404細(xì)胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)核心啟動子序列表達熒光素酶活性最高，結(jié)果與文獻報道中基本相同。接著我們觀察了LY294002對這四種DNMT3B啟動子活性影響，發(fā)現(xiàn)熒火蟲熒光素酶及作為內(nèi)參的海腎熒光素酶活性均比LY294002未處理組低，因此，我們采用LY294002處理pGL3-Basic質(zhì)粒(具有基本轉(zhuǎn)錄活性)前后相對熒光素酶活性比值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，若低于此標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為啟動子活性受到抑制。結(jié)果表明

10、，LY294002抑制DNMT3B啟動子活性。因此我們認(rèn)為PI3K/Akt信號通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了DNMT3B基因表達。在此部分中，我們還通過對DNMT3B的mRNA穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，LY294002可以促進DNMT3B mRNA降解，降低DNMT3B mRNA半衰期，表明LY294002對DNMT3B基因下調(diào)也存在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。實驗中我們觀察到HuR變化亦受LY294002調(diào)控，并呈現(xiàn)出時間效應(yīng)關(guān)系，鑒于有研究報道HuR可增加DNMT

11、3B基因穩(wěn)定性，因此，我們推測HuR可能作為LY294002促進DNMT3B mRNA降解的中介物。此部分的實驗結(jié)果表明PI3K/Akt信號通路可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控DNMT3B基因表達。
　　綜上所述，我們首次研究發(fā)現(xiàn)在人HCC細(xì)胞株BEL-7404中，PI3K/Akt信號通路可以下調(diào)DNMT3B基因表達，其下調(diào)機制是在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平；這一發(fā)現(xiàn)對我們認(rèn)識PI3K/Akt信號通路和DNMT3B基因在肝癌發(fā)生機制中的作用具有