PI3K-Akt通路重要分子的相互作用篩選及初步研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)綜合性的“生物化學(xué)工廠”，承擔(dān)多種生理功能。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，研究肝臟蛋白質(zhì)在相互作用中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)是全面認(rèn)識(shí)肝臟生理功能、理解其分子調(diào)控機(jī)理的重要手段。 細(xì)胞生長(zhǎng)因子在肝臟生長(zhǎng)發(fā)育、損傷和修復(fù)及功能調(diào)控中起關(guān)鍵作用。與肝臟相關(guān)的生長(zhǎng)因子包括HGF、EGF、insulin、TGFs等，激活MAPK、PI3K/Akt、SMAD等多條主要信號(hào)途徑，引起肝細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)發(fā)生等

2、多種生物學(xué)效應(yīng)。開(kāi)展肝臟相關(guān)生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究，是中國(guó)人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(CNHLPP)之蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖研究專題的重要組成部分。 蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸激酶Akt調(diào)控包括細(xì)胞存活、增殖、生長(zhǎng)、凋亡和糖原代謝在內(nèi)的多種生物學(xué)事件，在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移和葡萄糖代謝等過(guò)程中充當(dāng)著關(guān)鍵角色。本課題以PI3K/Akt通路重要分子為誘餌，采用酵母雙雜交方法篩選人肝臟cDNA文庫(kù)，從蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的角度，對(duì)肝

3、臟相關(guān)生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行初步研究。 本文成功構(gòu)建了31個(gè)誘餌載體，包括PI3K/Akt通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、激酶、負(fù)調(diào)控分子和代謝相關(guān)分子等，以其中28個(gè)符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的誘餌進(jìn)行了文庫(kù)篩選，獲得了488個(gè)候選陽(yáng)性克隆，去除非編碼區(qū)序列和不符合讀框的序列后，得到了101個(gè)蛋白之間93對(duì)非冗余的相互作用。其中有8對(duì)已知相互作用，與已有報(bào)道相比，相互作用數(shù)據(jù)具有較高的覆蓋率；未報(bào)道相互作用中17對(duì)出現(xiàn)頻率在兩次及兩次以上

4、，有較高的可信度。隨后采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法考察相互作用的可信度。實(shí)驗(yàn)部分，采用酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)針對(duì)技術(shù)假陽(yáng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨機(jī)選取的用于回轉(zhuǎn)驗(yàn)證的58對(duì)相互作用，陽(yáng)性率為76％。從中選取15對(duì)相互作用進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性率為67％，與已報(bào)道的人類相互作用組中高可信度數(shù)據(jù)的共親和純化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性比例(62％)相當(dāng)。生物信息學(xué)方面，我們采用了多種方法對(duì)生物學(xué)假陽(yáng)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，包括PubMed和HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)、轉(zhuǎn)錄組

5、和基因敲除表型、GO注釋、相互作用結(jié)構(gòu)域、模式生物同源性和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等。發(fā)現(xiàn)除8對(duì)已知相互作用外，還有10對(duì)(11％)相互作用的誘餌和獵物基因名共同出現(xiàn)在PubMed文獻(xiàn)中，提示它們具有較高的功能相關(guān)性；34對(duì)(37％)相互作用的誘餌和獵物有相同亞細(xì)胞定位；15對(duì)(16％)相互作用的誘餌和獵物共享第3級(jí)及3級(jí)以上GO注釋；37對(duì)(40％)誘餌和獵物有相同或相似的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為了從總體上描述相互作用的可信度，整合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和各種生物學(xué)相

6、關(guān)性分析的結(jié)果，采用簡(jiǎn)單投票的方式，建立了一個(gè)含11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的可信度評(píng)分體系。高、中、低可信度相互作用分別占到21％、62％和17％。使用該評(píng)分體系，已知相互作用均為中高可信度相互作用、整體分布比例與Stelzl等人蛋白質(zhì)相互作用研究比例相當(dāng)。 之后采用可視化軟件Osprey進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)繪圖和數(shù)據(jù)的深入挖掘，從獲得的網(wǎng)絡(luò)可以看到，通過(guò)Y2H得到的相互作用對(duì)原有相互作用進(jìn)行了有效補(bǔ)充和拓展，同時(shí)發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中存在著一個(gè)與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的成簇

7、的模塊。以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、可信度評(píng)價(jià)結(jié)果及大量的文獻(xiàn)調(diào)研為依據(jù)，對(duì)得到的相互作用數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入的挖掘。發(fā)現(xiàn)了以Akt2-HRSPl2和TRB3-HRSP12的相互作用介導(dǎo)的肝再生和細(xì)胞應(yīng)激之間潛在的交聯(lián)；通過(guò)GRB2-HNRPK和GRB2-SF384的相互作用揭示了GRB2在核內(nèi)的重要新功能：通過(guò)TRB3-SIAH1的相互作用揭示了TRB3的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步的功能研究提供了重要線索。 最后選取了一對(duì)高可信度、可能通過(guò)泛素化途徑調(diào)控P

8、I3K/Akt通路的相互作用——泛素連接酶SIAH1和腳手架蛋白TRB3之間的相互作用進(jìn)行了功能探討，初步實(shí)驗(yàn)表明SIAH1參與并促進(jìn)了TRB3的泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解，過(guò)表達(dá)情況下SIAH1可以部分解除TRB3對(duì)Akt磷酸化的抑制作用，由此，SIAH1參與了對(duì)TRB3參與的信號(hào)通路如PI3K/Akt通路的調(diào)控。 綜上所述，本研究采用酵母雙雜交方法，從蛋白質(zhì)相互作用層面上對(duì)肝臟PI3K/Akt通路重要分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行