ATM在孕激素治療子宮內(nèi)膜癌中的作用及其機制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。其中70％-80％為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌（內(nèi)膜樣腺癌），其與長期雌激素刺激，缺乏孕激素拮抗密切相關(guān)。目前對子宮內(nèi)膜癌，尤其是年輕Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變患者，大劑量孕激素治療仍然是最主要的保守治療方法，但是其具體的作用機制仍不明確。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病愈來愈年輕化，如何早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌和深入研究孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的機制具有重要的現(xiàn)實意義。既往研究認為孕激素可以通過與細胞核孕激素受

2、體(progesterone receptor，PR)結(jié)合誘導(dǎo)后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。本課題組采用反向蛋白芯片技術(shù)(reversephase protein array，RPPA)研究子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa及采用孕激素誘導(dǎo)而來的孕激素耐藥細胞株progestin-R Ishikawa時發(fā)現(xiàn)，兩種細胞株孕激素刺激后存在毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變基因蛋白(ataxia-telangiectasia，mutated,

3、 ATM)的差異性表達，在Ishikawa中孕激素能夠上調(diào)ATM的表達，在progestin-R Ishikawa細胞中則沒有。
　　ATM蛋白為A-T(ataxia-telangiectasia)基因編碼蛋白，是磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3-K）相關(guān)激酶家族的一員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，ATM基因突變導(dǎo)致機體無法產(chǎn)生完整有功能的ATM蛋白，造成毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥、淋巴瘤

4、等一系列疾病。ATM在DNA雙鏈斷裂修復(fù)(DNA double strand breaks DSB)和啟動細胞凋亡程序中起關(guān)鍵性調(diào)控作用。許多因素，包括放射線、化療藥物如順鉑、阿霉素以及癌基因蛋白Mye等均通過激活A(yù)TM，啟動ATM-Chk2-P53信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡，其表達異?；蛘吖δ苋笔c腫瘤的發(fā)生及耐藥密切相關(guān)。
　　二甲雙胍被證明在子宮內(nèi)膜癌中可以上調(diào)孕激素受體表達，還可以改善多種惡性腫瘤的治療，但是二甲雙胍對子宮內(nèi)膜

5、癌治療作用機制尚不清楚。
　　故本研究探討ATM在孕激素治療子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制，同時初步探索二甲雙胍治療子宮內(nèi)膜癌與ATM之間的關(guān)系。
　　本課題共分為三部分:一、ATM在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變中的表達情況。二、ATM在孕激素治療子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制研究。三、二甲雙胍治療子宮內(nèi)膜癌與ATM關(guān)系的初步探索。
　　第一部分:ATM在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變中的表達情況
　　目的:檢測ATM在Ⅰ型子宮內(nèi)

6、膜癌及其癌前病變中的表達情況，同時研究子宮內(nèi)膜癌組織中ATM表達與臨床病理分期、PR、ER(estrogen receptor)、P53、CK7、Ki67、Vimentin等指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　方法:1.采用免疫組化方法研究139例正常及增生性病變子宮內(nèi)膜組織:包括增生期子宮內(nèi)膜8例，分泌期子宮內(nèi)膜6例，單純性增生過長10例，復(fù)雜性增生過長13例，不典型增生過長11例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌91例，ATM在其中的表達情況。2.采用免疫組

7、化方法研究91例子宮內(nèi)膜癌組織（Ⅰ級58例，Ⅱ級17例，Ⅲ級8例，另8例資料不全予剔除）中ATM、PR、ER、P53、CK7、Ki67、Vimentin表達情況。3.采用SPSS19.0進行分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)準。
　　結(jié)果:1.采用秩和檢驗各組ATM表達情況，各組平均秩分別為:增生期:112.50;分泌期:129;單純性增生過長:78.25;復(fù)雜性增生過長:71.04;不典型增生過長:70.05;Ⅰ型子宮內(nèi)膜

8、癌:59.58.ATM表達組間存在顯著差異(P=0.000)。與增生期子宮內(nèi)膜相比，分泌期子宮內(nèi)膜ATM表達最高，子宮內(nèi)膜增生性病變各組ATM表達隨病變程度加重呈逐漸下降，在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中表達最低。2.Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織中ATM表達與病理級別呈負相關(guān)（Kendall系數(shù)=-0.269，P=0.011）。ATM表達情況與病例FIGO分期、肌層浸潤情況無顯著相關(guān)性(P＞0.05)，與其余指標(biāo)(P53、PR、ER、CK7、Vimentin、

9、Ki67)也無顯著相關(guān)(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.ATM在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變中表達顯著低于正常子宮內(nèi)膜，ATM表達降低可能與子宮內(nèi)膜癌相關(guān):2.ATM在分泌期表達高于增生期，提示其表達可能與孕激素相關(guān);3.ATM表達與子宮內(nèi)膜癌的病理級別呈負相關(guān)，進一步提示ATM低表達或者缺失可能與子宮內(nèi)膜癌的惡性程度相關(guān);4.子宮內(nèi)膜癌中ATM表達與病例FIGO分期、肌層浸潤、P53、PR、ER、CK7、Vimentin、Ki67

10、等無相關(guān)性。
　　第二部分:ATM在孕激素治療子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制研究
　　目的:研究ATM在孕激素治療子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制。
　　方法:采用三組子宮內(nèi)膜癌細胞株:孕激素受體陽性細胞株:Ishikawa和RL95-2，孕激素受體陰性細胞株:progestin-R Ishikawa作為研究對象;采用Western Blot檢測孕激素作用后ATM表達情況;采用siRNA方法沉默ATM基因表達;采用CCK-8檢測細胞

11、在ATM沉默前后孕激素抑制細胞增殖情況;采用流式細胞技術(shù)檢測在ATM沉默前后孕激素促凋亡情況。采用western blot檢測ATM沉默前后ATM-CHK2-P53-caspase3信號通路中節(jié)點蛋白表達情況。
　　結(jié)果:1.孕激素治療后Ishikawa、RL95-2細胞中ATM表達上調(diào)，對progestin-R Ishikawa中ATM表達無影響。2.沉默ATM后孕激素抑制Ishikawa、RL95-2細胞增殖作用被抑制，在Is

12、hikawa細胞，沉默ATM前后孕激素抑制率分別為20.10％和2.93％，在RL95-2細胞為25.2％和0.03％;沉默ATM前后，孕激素對progestin-R Ishikawa均無明顯抑制作用。3.沉默ATM不能阻斷孕激素對Ishikawa、RL95-2的促凋亡作用，在Ishikawa細胞沉默ATM前后孕激素誘導(dǎo)的凋亡率分別為16.87±0.44(％)和17.86±0.72(％)(P=0.0213)，在RL95-2細胞為12.8

13、0±0.89(％)和15.67±0.72(％)(P=0.0373);沉默ATM前后，孕激素對progestin-R Ishikawa細胞均無明顯促凋亡作用。4.在Ishikawa和RL95-2細胞，孕激素能夠上調(diào)ATM、pChk2、Chk2、p-P53、P53和caspase3表達，沉默ATM后，孕激素上調(diào)作用被抑制;在progestin-R Ishikawa細胞，沉默ATM前后，孕激素均不能上調(diào)上述蛋白表達。
　　結(jié)論:1.孕激

14、素可能通過PR介導(dǎo)活化ATM-Chk2-P53-caspase3信號通路抑制細胞增殖，可能并不通過上述通路參與孕激素促進細胞凋亡作用;2.沉默ATM表達，能夠阻斷孕激素抑制細胞增殖作用，但是不能完全阻斷其促凋亡作用，可能存在其它信號通路的活化或其它作用機制的激活。
　　第三部分:二甲雙胍治療子宮內(nèi)膜癌與ATM關(guān)系的初步探索
　　目的:初步探索二甲雙胍治療子宮內(nèi)膜癌與ATM的關(guān)系
　　方法:采用子宮內(nèi)膜癌細胞株RL95-

15、2;采用Western Blot檢測二甲雙胍作用RL95-2后ATM、P53和Chk2表達情況。
　　結(jié)果:二甲雙胍治療后RL952細胞中ATM、P53、Chk2蛋白的表達上調(diào)。
　　結(jié)論:二甲雙胍可能可以通過活化ATM-Chk2-P53信號通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，其與孕激素可能具有協(xié)同作用，可以作為子宮內(nèi)膜癌藥物治療研究的一個新靶點。
　　上述結(jié)果提示:1.ATM蛋白低表達可能與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)，病理級別越高，

16、其表達越低。2.孕激素可以上調(diào)ATM表達，通過活化ATM-Chk2-P53-caspase3信號通路抑制細胞增殖，沉默ATM可以阻斷孕激素抑制增殖作用，但不能完全阻斷其促凋亡作用。3.二甲雙胍可能通過活化上述通路誘導(dǎo)細胞凋亡，其可以作為子宮內(nèi)膜癌藥物治療研究的一個新靶點。
　　本課題研究表明:ATM表達缺失可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān);ATM-PR-Chk2-P53-caspase3信號通路是孕激素作用于子宮內(nèi)膜癌細胞的重