腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是女性最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中70％-80％為Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌，普遍認(rèn)為其發(fā)生與長(zhǎng)期無(wú)孕激素拮抗的雌激素刺激相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變患者血清雌激素水平并不高于健康同齡婦女，提示可能存在其他機(jī)制參與Ⅰ型內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　對(duì)其他實(shí)體腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌與胰島素

2、抵抗密切相關(guān)，而慢性炎癥是后者的重要臨床表現(xiàn)之一。也有研究顯示，作為慢性炎癥的具體表現(xiàn)形式，在子宮內(nèi)膜癌病灶存在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，后者與子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。提示巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可能在Ⅰ型內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但其作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　人體內(nèi)的單核/巨噬細(xì)胞可被誘導(dǎo)活化為不同表型:M1型和M2型，目前，M2型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是在多數(shù)腫瘤中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，也被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated

3、macrophages，TAMs)。以TAMs浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)與多種腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞激素受體的表達(dá)。在前列腺癌，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可上調(diào)雄激素受體表達(dá)，促進(jìn)雄激素對(duì)前列腺的致癌作用。在乳腺癌，肥胖造成的慢性炎癥狀態(tài)可激活乳腺癌局部的雌激素受體。
　　因此，我們推測(cè)子宮內(nèi)膜病灶局部TAMs浸潤(rùn)可能通過(guò)調(diào)控雌激素受體，增加內(nèi)膜局部對(duì)雌激素的敏感性，促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。
　　本研究擬通過(guò)分析巨

4、噬細(xì)胞浸潤(rùn)與子宮內(nèi)膜癌和癌前病變的相關(guān)性，以及巨噬細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜癌雌激素受體的調(diào)控及其對(duì)雌激素的敏感性，驗(yàn)證上述假設(shè)，并進(jìn)一步分析可能的機(jī)制所在。具體分為四部分:第一部分:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變患者血清雌激素水平分析;第二部分:巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變的相關(guān)性分析;第三部分:TAMs通過(guò)ERα調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素敏感性;第四部分:TAMs通過(guò)IL-17調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ERα表達(dá)。
　　第一

5、部分:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平分析
　　目的:檢測(cè)血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。
　　方法:1.收集2011年9月至2013年12月，子宮內(nèi)膜正常及發(fā)生增生性病變患者的一般情況和血清雌二醇(Estradiol，E2)水平資料，包括對(duì)照組39例，增生紊亂69例，單純性增生過(guò)長(zhǎng)168例，復(fù)雜性增生過(guò)長(zhǎng)67例，不典型增生33例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌25例，共收集病例401例。所有血液學(xué)檢測(cè)均在本院檢驗(yàn)

6、科執(zhí)行。統(tǒng)計(jì)分析血清雌激素水平，采用Graph pad prism5.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.收集2011年9月至2013年12月，子宮內(nèi)膜正常及內(nèi)膜癌患者血清，包括對(duì)照組34例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌34例，共收集病例68例。相同年齡正常及內(nèi)膜癌患者配對(duì)比較。ELISA檢測(cè)血清雌激素水平。采用Graph pad prism5.0進(jìn)行paired t test分析，以P=0

7、.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.臨床資料顯示，雌二醇水平在各組分布分別為:95.00±68.81ng/L、151.8±163.2 ng/L、156.4±178.8 ng/L、138.4±330.0 ng/L、125.5±156.7 ng/L、36.52±45.35 ng/L，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。以40歲為界，將患者分為25～40歲和40～55歲兩個(gè)年齡段，25～40歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分

8、別為:107.1±70.73 ng/L、140.3±165.2 ng/L、122.1±129.6 ng/L、76.59±59.86 ng/L和120.1±179.2 ng/L;40～55歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分別為:102.2±63.36 ng/L、161.1±154.5 ng/L、164.0±20.6 ng/L、148.1±152.6 ng/L、148.3±122.5 ng/L和76.86±68.13 ng/L，同一年齡段的

9、各組間雌二醇水平分布不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.Elisa結(jié)果顯示，雌二醇水平在對(duì)照組與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組按同一年齡配對(duì)比較:P=0.8338，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平并不高于內(nèi)膜正常婦女。提示可能存在其他機(jī)制參與內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變的相關(guān)性分析
　　目的:檢測(cè)巨噬細(xì)胞在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變中的

10、浸潤(rùn)情況，分析二者間的相關(guān)性。
　　方法:收集正常及增生性病變子宮內(nèi)膜組織共140例:包括增殖期、分泌期、單純型增生、復(fù)雜型增生子宮內(nèi)膜各20例，不典型增生子宮內(nèi)膜、Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌各30例，CD68免疫組化染色，計(jì)數(shù)各期別CD68(+)細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)CD68(+)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜中的浸潤(rùn)情況。采用Graph pad prism5.0進(jìn)行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.CD

11、68表達(dá)于巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜。2.各組中CD68+細(xì)胞數(shù)目分別是（每400倍視野）:增殖期:6.641±5.463個(gè);分泌期:13.82±10.36個(gè);單純型增生:20.45±10.17個(gè);復(fù)雜型增生:35.70±14.73個(gè);不典型增生期:41.98±15.74個(gè);Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌:57.80±25.72個(gè)，與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌相比均有P＜0.001，CD68(+)細(xì)胞數(shù)與子宮內(nèi)膜增生性病變進(jìn)展呈正相關(guān)。3.隨子宮內(nèi)膜增生性病變進(jìn)展，巨噬

12、細(xì)胞浸潤(rùn)部位由血管周圍、間質(zhì)向腺上皮轉(zhuǎn)變。4.隨病變進(jìn)展，巨噬細(xì)胞形態(tài)逐漸成熟。
　　結(jié)論:CD68(+)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)數(shù)目、部位及形態(tài)可能與Ⅰ子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　第三部分:TAMs通過(guò)ERα調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素敏感性
　　目的:研究TAMs在促進(jìn)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)雌二醇敏感性中的作用，并進(jìn)一步分析可能的機(jī)制。
　　方法:采用兩種雌激素受體陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishi

13、kawa和HEC-1-A作為研究對(duì)象;培養(yǎng)單核細(xì)胞系THP-1，并誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，即TAMs;子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞與M2型THP-1共培養(yǎng)，或經(jīng)M2型THP-1的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CCK-8檢測(cè)共培養(yǎng)前后內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖情況，以及對(duì)生理劑量(10-9M) E2的敏感性改變，并將此變化與過(guò)表達(dá)ERα或應(yīng)用ERα抑制劑ICI后的趨勢(shì)相比較，采用Graph pad prism5.0進(jìn)行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差

14、異標(biāo)準(zhǔn);Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)內(nèi)膜癌細(xì)胞與M2型THP-1共培養(yǎng)后雌激素受體α(ERα)的表達(dá)變化，并采用細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1驗(yàn)證細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:1.人M2型THP-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)活化成功，形態(tài)改變明顯，表型鑒定CD68、CD163、CD204和CD206顯著升高。2.M2型THP-1與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa或HEC-1-A共培養(yǎng)后，內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖均被促進(jìn);生理劑

15、量的E2對(duì)兩株細(xì)胞的促增殖作用亦被上調(diào);該現(xiàn)象可被雌激素受體抑制劑ICI抑制。3.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時(shí)間依賴性促進(jìn)Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞增殖，上調(diào)生理劑量雌激素對(duì)內(nèi)膜癌細(xì)胞的促增殖作用，其促增殖作用同樣可被ICI抑制。4.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時(shí)間依賴性上調(diào)雌激素受體α表達(dá)，而對(duì)雌激素受體β無(wú)明顯作用;CM可時(shí)間依賴性上調(diào)cyclinD1表達(dá);5.M2型THP-1對(duì)雌激素促增殖作用的上調(diào)

16、作用與內(nèi)膜癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)ERα后細(xì)胞增殖增強(qiáng)情況類似。
　　結(jié)論:TAMs可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1-A增殖及對(duì)雌激素的敏感性，這種作用可能是通過(guò)上調(diào)內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素受體α實(shí)現(xiàn)的。
　　第四部分:TAMs通過(guò)IL-17調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ERα表達(dá)
　　目的:篩選TAMs中可能在促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用的炎癥因子，研究其在促Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及雌激素敏感性方面的作用，并探索可能的機(jī)制。<

17、br>　　方法:M2型THP-1與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-A經(jīng)Transwell共培養(yǎng)后，提取M2型THP-1細(xì)胞的RNA行Real-time PCR篩選穩(wěn)定作用的炎癥因子;采用CCK-8驗(yàn)證篩選的炎癥因子對(duì)HEC-1-A的促增殖及促雌激素敏感性作用，采用Graph pad prism5.0進(jìn)行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn);Real-time PCR和Western blot驗(yàn)證該炎癥因子對(duì)HEC

18、-1-A的ERα表達(dá)調(diào)控;Western blot驗(yàn)證該炎癥因子和E2共同作用于HEC-1-A細(xì)胞后，對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖的p-AKT信號(hào)通路的活化作用。
　　結(jié)果:1.經(jīng)篩選，與HEC-1-A共培養(yǎng)后M2型THP-1細(xì)胞炎癥因子IL-10和IL-17表達(dá)明顯增加;2.IL-10和IL-17均可上調(diào)E2對(duì)HEC-1-A細(xì)胞的促增殖作用，且IL-17作用更強(qiáng);3.IL-10、IL-17或E2處理后，均可上調(diào)HEC-1-A的ERα表達(dá)，且I

19、L-17作用更強(qiáng)，進(jìn)一步篩選出IL-17作為研究對(duì)象;4.IL-17與E2共同處理HEC-1-A細(xì)胞后，其p-AKT信號(hào)通路活化顯著增強(qiáng)，此作用與HEC-1-A細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)ERα后加用E2相似。
　　結(jié)論:TAMs通過(guò)IL-17上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ERα的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)雌激素敏感性增加，增強(qiáng)雌激素對(duì)內(nèi)膜癌細(xì)胞的促增殖作用。
　　上述結(jié)果提示:1.血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內(nèi)膜增生性病變的進(jìn)展無(wú)顯著相關(guān)性，雌激素對(duì)內(nèi)

20、膜的促癌作用可能存在其他機(jī)制;2.巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與Ⅰ型子宮內(nèi)膜增生性病變進(jìn)展呈正相關(guān)，慢性炎癥可能在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用;3.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)上調(diào)內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素受體α表達(dá)增強(qiáng)雌激素對(duì)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的促增殖作用，慢性炎癥對(duì)雌激素敏感性的調(diào)控可能是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的重要原因;4.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌炎癥因子，如白介素-17，上調(diào)內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素受體α表達(dá)，從而提高內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)雌激素敏感性?？赡苁莾?nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展