腫瘤相關巨噬細胞在子宮內膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究.pdf

1、子宮內膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中70％-80％為Ⅰ型子宮內膜樣腺癌，普遍認為其發(fā)生與長期無孕激素拮抗的雌激素刺激相關。我們的前期研究發(fā)現，Ⅰ型子宮內膜癌及其癌前病變患者血清雌激素水平并不高于健康同齡婦女，提示可能存在其他機制參與Ⅰ型內膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　對其他實體腫瘤的研究發(fā)現，炎癥刺激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量流行病學研究發(fā)現，Ⅰ型子宮內膜癌與胰島素

2、抵抗密切相關，而慢性炎癥是后者的重要臨床表現之一。也有研究顯示，作為慢性炎癥的具體表現形式，在子宮內膜癌病灶存在巨噬細胞浸潤，后者與子宮內膜癌的不良預后密切相關。提示巨噬細胞浸潤可能在Ⅰ型內膜癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但其作用和機制還有待進一步研究。
　　人體內的單核/巨噬細胞可被誘導活化為不同表型:M1型和M2型，目前，M2型巨噬細胞被認為是在多數腫瘤中浸潤的巨噬細胞，也被稱為腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated

3、macrophages，TAMs)。以TAMs浸潤為主的炎癥反應與多種腫瘤的預后不良有關。研究發(fā)現，巨噬細胞浸潤可調控腫瘤細胞激素受體的表達。在前列腺癌，巨噬細胞浸潤可上調雄激素受體表達，促進雄激素對前列腺的致癌作用。在乳腺癌，肥胖造成的慢性炎癥狀態(tài)可激活乳腺癌局部的雌激素受體。
　　因此，我們推測子宮內膜病灶局部TAMs浸潤可能通過調控雌激素受體，增加內膜局部對雌激素的敏感性，促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。
　　本研究擬通過分析巨

4、噬細胞浸潤與子宮內膜癌和癌前病變的相關性，以及巨噬細胞對子宮內膜癌雌激素受體的調控及其對雌激素的敏感性，驗證上述假設，并進一步分析可能的機制所在。具體分為四部分:第一部分:Ⅰ型子宮內膜癌及內膜增生性病變患者血清雌激素水平分析;第二部分:巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內膜癌及內膜增生性病變的相關性分析;第三部分:TAMs通過ERα調控Ⅰ型子宮內膜癌細胞雌激素敏感性;第四部分:TAMs通過IL-17調控Ⅰ型子宮內膜癌細胞ERα表達。
　　第一

5、部分:Ⅰ型子宮內膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平分析
　　目的:檢測血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的相關性。
　　方法:1.收集2011年9月至2013年12月，子宮內膜正常及發(fā)生增生性病變患者的一般情況和血清雌二醇(Estradiol，E2)水平資料，包括對照組39例，增生紊亂69例，單純性增生過長168例，復雜性增生過長67例，不典型增生33例，Ⅰ型子宮內膜癌25例，共收集病例401例。所有血液學檢測均在本院檢驗

6、科執(zhí)行。統(tǒng)計分析血清雌激素水平，采用Graph pad prism5.0軟件進行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　2.收集2011年9月至2013年12月，子宮內膜正常及內膜癌患者血清，包括對照組34例，Ⅰ型子宮內膜癌34例，共收集病例68例。相同年齡正常及內膜癌患者配對比較。ELISA檢測血清雌激素水平。采用Graph pad prism5.0進行paired t test分析，以P=0

7、.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　結果:1.臨床資料顯示，雌二醇水平在各組分布分別為:95.00±68.81ng/L、151.8±163.2 ng/L、156.4±178.8 ng/L、138.4±330.0 ng/L、125.5±156.7 ng/L、36.52±45.35 ng/L，結果不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。以40歲為界，將患者分為25～40歲和40～55歲兩個年齡段，25～40歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分

8、別為:107.1±70.73 ng/L、140.3±165.2 ng/L、122.1±129.6 ng/L、76.59±59.86 ng/L和120.1±179.2 ng/L;40～55歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分別為:102.2±63.36 ng/L、161.1±154.5 ng/L、164.0±20.6 ng/L、148.1±152.6 ng/L、148.3±122.5 ng/L和76.86±68.13 ng/L，同一年齡段的

9、各組間雌二醇水平分布不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　2.Elisa結果顯示，雌二醇水平在對照組與Ⅰ型子宮內膜癌組按同一年齡配對比較:P=0.8338，無統(tǒng)計學意義。
　　結論:Ⅰ型子宮內膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平并不高于內膜正常婦女。提示可能存在其他機制參與內膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內膜癌及內膜增生性病變的相關性分析
　　目的:檢測巨噬細胞在Ⅰ型子宮內膜癌及癌前病變中的

10、浸潤情況，分析二者間的相關性。
　　方法:收集正常及增生性病變子宮內膜組織共140例:包括增殖期、分泌期、單純型增生、復雜型增生子宮內膜各20例，不典型增生子宮內膜、Ⅰ型子宮內膜癌各30例，CD68免疫組化染色，計數各期別CD68(+)細胞數，評價CD68(+)巨噬細胞在子宮內膜中的浸潤情況。采用Graph pad prism5.0進行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　結果:1.CD

11、68表達于巨噬細胞的胞質和胞膜。2.各組中CD68+細胞數目分別是（每400倍視野）:增殖期:6.641±5.463個;分泌期:13.82±10.36個;單純型增生:20.45±10.17個;復雜型增生:35.70±14.73個;不典型增生期:41.98±15.74個;Ⅰ型子宮內膜癌:57.80±25.72個，與Ⅰ型子宮內膜癌相比均有P＜0.001，CD68(+)細胞數與子宮內膜增生性病變進展呈正相關。3.隨子宮內膜增生性病變進展，巨噬

12、細胞浸潤部位由血管周圍、間質向腺上皮轉變。4.隨病變進展，巨噬細胞形態(tài)逐漸成熟。
　　結論:CD68(+)巨噬細胞在子宮內膜浸潤數目、部位及形態(tài)可能與Ⅰ子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展有關。
　　第三部分:TAMs通過ERα調控Ⅰ型子宮內膜癌細胞雌激素敏感性
　　目的:研究TAMs在促進Ⅰ型子宮內膜癌細胞增殖及內膜癌細胞對雌二醇敏感性中的作用，并進一步分析可能的機制。
　　方法:采用兩種雌激素受體陽性的子宮內膜癌細胞株Ishi

13、kawa和HEC-1-A作為研究對象;培養(yǎng)單核細胞系THP-1，并誘導為M2型巨噬細胞，即TAMs;子宮內膜癌細胞與M2型THP-1共培養(yǎng)，或經M2型THP-1的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CCK-8檢測共培養(yǎng)前后內膜癌細胞增殖情況，以及對生理劑量(10-9M) E2的敏感性改變，并將此變化與過表達ERα或應用ERα抑制劑ICI后的趨勢相比較，采用Graph pad prism5.0進行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差

14、異標準;Real-time PCR和Western Blot檢測內膜癌細胞與M2型THP-1共培養(yǎng)后雌激素受體α(ERα)的表達變化，并采用細胞增殖相關蛋白CyclinD1驗證細胞增殖情況。
　　結果:1.人M2型THP-1巨噬細胞誘導活化成功，形態(tài)改變明顯，表型鑒定CD68、CD163、CD204和CD206顯著升高。2.M2型THP-1與Ⅰ型子宮內膜癌細胞Ishikawa或HEC-1-A共培養(yǎng)后，內膜癌細胞增殖均被促進;生理劑

15、量的E2對兩株細胞的促增殖作用亦被上調;該現象可被雌激素受體抑制劑ICI抑制。3.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時間依賴性促進Ishikawa和HEC-1-A細胞增殖，上調生理劑量雌激素對內膜癌細胞的促增殖作用，其促增殖作用同樣可被ICI抑制。4.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時間依賴性上調雌激素受體α表達，而對雌激素受體β無明顯作用;CM可時間依賴性上調cyclinD1表達;5.M2型THP-1對雌激素促增殖作用的上調

16、作用與內膜癌細胞過表達ERα后細胞增殖增強情況類似。
　　結論:TAMs可促進子宮內膜癌細胞Ishikawa和HEC-1-A增殖及對雌激素的敏感性，這種作用可能是通過上調內膜癌細胞雌激素受體α實現的。
　　第四部分:TAMs通過IL-17調控Ⅰ型子宮內膜癌細胞ERα表達
　　目的:篩選TAMs中可能在促進內膜癌細胞增殖中起關鍵作用的炎癥因子，研究其在促Ⅰ型子宮內膜癌細胞增殖及雌激素敏感性方面的作用，并探索可能的機制。<

17、br>　　方法:M2型THP-1與子宮內膜癌細胞HEC-1-A經Transwell共培養(yǎng)后，提取M2型THP-1細胞的RNA行Real-time PCR篩選穩(wěn)定作用的炎癥因子;采用CCK-8驗證篩選的炎癥因子對HEC-1-A的促增殖及促雌激素敏感性作用，采用Graph pad prism5.0進行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準;Real-time PCR和Western blot驗證該炎癥因子對HEC

18、-1-A的ERα表達調控;Western blot驗證該炎癥因子和E2共同作用于HEC-1-A細胞后，對調控細胞增殖的p-AKT信號通路的活化作用。
　　結果:1.經篩選，與HEC-1-A共培養(yǎng)后M2型THP-1細胞炎癥因子IL-10和IL-17表達明顯增加;2.IL-10和IL-17均可上調E2對HEC-1-A細胞的促增殖作用，且IL-17作用更強;3.IL-10、IL-17或E2處理后，均可上調HEC-1-A的ERα表達，且I

19、L-17作用更強，進一步篩選出IL-17作為研究對象;4.IL-17與E2共同處理HEC-1-A細胞后，其p-AKT信號通路活化顯著增強，此作用與HEC-1-A細胞轉染過表達ERα后加用E2相似。
　　結論:TAMs通過IL-17上調子宮內膜癌細胞ERα的表達，從而促進內膜癌細胞對雌激素敏感性增加，增強雌激素對內膜癌細胞的促增殖作用。
　　上述結果提示:1.血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內膜增生性病變的進展無顯著相關性，雌激素對內

20、膜的促癌作用可能存在其他機制;2.巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內膜增生性病變進展呈正相關，慢性炎癥可能在Ⅰ型子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用;3.腫瘤相關巨噬細胞通過上調內膜癌細胞雌激素受體α表達增強雌激素對Ⅰ型子宮內膜癌細胞的促增殖作用，慢性炎癥對雌激素敏感性的調控可能是Ⅰ型子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的重要原因;4.腫瘤相關巨噬細胞通過分泌炎癥因子，如白介素-17，上調內膜癌細胞雌激素受體α表達，從而提高內膜細胞對雌激素敏感性?？赡苁莾饶ぐ┌l(fā)生發(fā)展