子宮內(nèi)膜癌細胞增殖中雌激素的非核效應及其機制.pdf

1、第一部分
　　 目的：通過對子宮內(nèi)膜癌組織中Erα表達水平的檢測，探討其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關系；通過檢測子宮內(nèi)膜癌細胞表面Erα的表達及其受雌激素調控的研究，了解雌激素膜受體的在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達，為后續(xù)雌激素非核效應在子宮內(nèi)膜癌細胞中的研究打下基礎。
　　 方法：采用免疫組織化學鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(SABC)，對33例子宮內(nèi)膜癌組織標本中Erα的蛋白表達及表達部位情況進行檢測。通過半

2、定量積分綜合計量法分析結果。采用免疫熒光染色檢測子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa和HEC-1B細胞膜表面Erα的表達。用流式細胞儀計數(shù)和分析結果。
　　 結果：在子宮內(nèi)膜癌組織中，Erα的表達陽性率隨著臨床期別的增加而下降(p＝0.047)；隨著病理分級級別的增高而下降(p＝0.01)；隨著肌層浸潤的加深而下降(p＝0.033)。Erα在胞漿和胞膜上出現(xiàn)的比率也隨臨床期別、病理分級、肌層浸潤程度的增加而上升，但只在肌層浸潤的深淺

3、組別間有統(tǒng)計學差異(p＝0.024)。在Ishikawa細胞可以檢測到有3％的細胞膜表面存在Erα的表達，且受雌激素的調控，E2作用1小時后，膜上有熒光的細胞數(shù)量增加，但作用24小時后，帶有熒光的細胞數(shù)量則減少。E2-BSA作用下，則膜表面帶有熒光的細胞數(shù)量在1小時和24小時后持續(xù)增加。在HEC-1B細胞中檢測不到細胞膜表面的Erα表達。
　　 結論：Erα的表達隨著子宮內(nèi)膜癌病程的進展而下降，Erα在細胞漿和細胞膜上的出現(xiàn)可能

4、與子宮內(nèi)膜癌的侵襲能力的增加有關。在子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa細胞膜表面存在一小部分雌激素的胞膜受體，其表達受雌激素的調控。
　　 第二部分
　　 目的：檢測雌激素的非核效應在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖中的作用，并通過研究各種抑制劑對雌激素的增殖作用的影響，探討雌激素非核效應在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖中可能的作用途徑。
　　 方法：采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度E2以及E2-BSA作用下子宮內(nèi)膜癌細胞株I

5、shikawa和HEC-1B的增殖情況，以及雌激素受體拮抗劑ICI 182780、MEK1抑制劑PD98059和HB-EGF中和抗體對雌激素促增殖作用的影響。
　　 結果：Ishikawa細胞在E2和E2-BSA達到1×10-8M以上濃度時才出現(xiàn)明顯的細胞增殖(p<0.05)；而在HEC-1B細胞中，E2則要達到1×10-7M濃度才能出現(xiàn)相同的增殖效應(p<0.01)。ICI 180780和PD 98059都能夠顯著抑制E2和E

6、2-BSA在Ishikawa細胞中引發(fā)的細胞增殖作用(p<0.05)；HB-EGF中和抗體只對E2-BSA作用下Ishikawa細胞的增殖具有抑制效果(p<0.01)。在HEC-1B細胞中這三種抑制劑對雌激素誘導的細胞增殖都沒有顯著作用。
　　 結論：不能通過細胞膜的E2-BSA具有與17β雌二醇同樣的促進子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa和HEC-1B增殖的作用。說明雌激素的非核效應同樣也能引發(fā)子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖活動。而這種雌激

7、素的促增殖效應在Ishikawa細胞中能夠被雌激素受體的拮抗劑所阻斷，可以由此推測雌激素的核效應和非核效應促增殖的作用都是通過雌激素受體發(fā)揮的。PD 98059也能阻斷這一增殖效應，提示MAPK信號通路可能在雌激素誘導的細胞增殖中發(fā)揮著某種作用。HB-EGF中和抗體只對E2-BSA作用的Ishikawa細胞的增殖有抑制作用，提示HB-EGF可能是雌激素非核效應在雌激素受體陽性子宮內(nèi)膜癌細胞中促進細胞增殖效應中的一環(huán)。
　　 第三

8、部分
　　 目的：通過檢測子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa和HEC-1B細胞在雌激素作用后細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化、[Ca2+]I濃度的變化、以及分泌至細胞外的HB-EGF的含量的迅速改變，探討在子宮內(nèi)膜癌細胞中，雌激素非核效應的信號傳導途徑。
　　 方法：采用Western Blot方法檢測E2和E2-BSA分別作用后子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa和HEC-1B胞漿中ERK1/2的磷酸化程度，來反映M

9、APK通路的激活。利用光吸收指示劑法，在熒光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀測加入E2和E2-BSA后，子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。E2和E2-BSA分別作用于子宮內(nèi)膜癌細胞15分鐘后，收集培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測上清中HB-EGF的含量變化。同時檢測ICI 182780、PD 98059和HB-EGF中和抗體對這些信號分子改變的影響。
　　 結果：在Ishikawa細胞中ERK1/2的活化在E2和E2-BSA濃度為 1×10-8

10、M時最強，在HEC-1B細胞中則在E2為1×10-7M時，ERK1/2才出現(xiàn)明顯活化。在雌激素對MAPK活化的時效性研究中，E2以及E2-BSA的作用濃度為1×10-8M時，Ishikawa和HEC-1B細胞在2分鐘時就都出現(xiàn)了ERK1/2的磷酸化，分別在15分鐘和30分鐘達到峰值。當對Ishikawa細胞給以ICI 182780預處理后，E2和E2-BSA對ERK1/2的活化作用被抑制；在用HB-EGF中和抗體處理過Ishikawa細

11、胞后，只有對E2-BSA作用后ERK1/2的磷酸化有抑制作用。而HEC-1B細胞中ERK1/2的活化則不受ICI 182780和HB-EGF中和抗體的影響。
　　 E2和E2-BSA都能促進Ishikawa細胞內(nèi)鈣的增加，ICI 182780能明顯抑制鈣離子的增加率。而在HEC-1B細胞中，也能見到E2和E2-BSA作用后胞內(nèi)鈣離子濃度的緩慢增加，但ICI 182780對其沒有抑制作用。
　　 在Ishikawa細胞的培

12、養(yǎng)上清中，只有E2-BSA作用組有HB-EGF的明顯增加(p<0.01),并且ICI 182780能夠抑制這種增加。而在HEC-1B細胞上清中則沒有HB-EGF含量的明顯改變。
　　 結論：能夠透膜進入細胞內(nèi)的E2和不能透膜的E2-BSA都能夠引發(fā)子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)ERK的快速磷酸化，以及細胞內(nèi)鈣的增加，并且這種作用在Ishikawa細胞能夠被ER的拮抗劑ICI 182780所抑制，可以推測雌激素的這種非核效應是由雌激素受體介導的