HuR siRNA對子宮內膜癌細胞體外增殖和凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　 子宮內膜癌是女性生殖道腫瘤發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，近年來由于女性壽命延長，高齡及肥胖女性增加，發(fā)病率逐年上升。長期以來對子宮內膜癌的病因學研究一直是重點。但目前為止，子宮內膜癌發(fā)生的確切機制仍不清楚。近來有關研究證實RNA結合蛋白（RNABPs）HuR在介導腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展方面發(fā)揮重要作用。
　　 HuR，是胚胎致死異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家

2、族的一員，作為RNABPs，能通過結合并且穩(wěn)定在3’非翻譯區(qū)（UTR）中富含A，U（AREs）的片段，發(fā)揮其mRNA的轉錄后調控作用。編碼細胞因子、淋巴因子及原癌基因的一類早期反應基因（ERGS）mRNA均含有AREs。以往的研究證實，HuR能在多種細胞系中表達，如：卵巢癌、乳腺癌、肺癌等細胞系。子宮內膜癌是一種雌激素依賴性腫瘤。雌激素受體有兩型，即ER-α和ER-β，它們同屬配體介導的核受體超家族成員。ER水平的改變可以通過調控轉錄、

3、轉錄后及表現(xiàn)遺傳學水平引起。ER-α的轉錄后水平的調控，與RNA結合蛋白結合其AREs，編碼ER-α mRNA，從而調控ER-α有效的蛋白翻譯有關[1-3]。ER 3’UTR是一段4500的核苷酸片段，含有7個AREs，屬于AREs分類中的第1類，即在富含U區(qū)包含1.3個AUUUA拷貝[4]。但在目前的研究中，HuR在子宮內膜癌中的表達情況及其對ER-α作用機制尚不清楚。
　　 本實驗擬通過細胞免疫熒光檢測HuR在Ishikaw

4、a子宮內膜癌細胞的表達情況并運過RNAi技術，將構建的HuR siRNA表達質粒轉染入Ishikawa細胞，探討HuR沉默后對子宮內膜癌生物學特性及ER-α蛋白表達情況的影響，初步闡明HuR在子宮內膜癌發(fā)病機制中的作用以及與子宮內膜癌發(fā)生與發(fā)展的關系。
　　 方法：
　　 用細胞免疫熒光方法測定HuR在子宮內膜癌Ishikawa細胞系中的表達、轉染前后的變化；用脂質體轉染法將構建的HuR siRNA表達質粒轉染入子宮內膜

5、癌細胞。用RT-PCR和Western-Blot觀察轉染24h、48h、72h后子宮內膜癌Ishikawa細胞中HuR mRNA、蛋白的表達及ER-α蛋白表達情況；以及應用流式細胞技術及MTT比色法分別檢測轉染后子宮內膜癌Ishikawa細胞周期、凋亡及增殖的變化情況。
　　 結果：
　　 1、構建HuR siRNAs并測序，測序結果與設計相符；將設計的三條HuR-siRNA分別轉染入子宮內膜癌細胞，HuR-siRNAl

6、、HuR-siRNA2、HuR-siRNA3對Ishikawa細胞中HuR mRNA表達抑制率分別為55.48％、82.81％、67.59％；故將構建的HuR-siRNA2質粒用作后續(xù)轉染實驗。
　　 2、HuR免疫熒光結果顯示：HuR在Ishikawa細胞的胞核和胞漿中都有表達，但主要表達于胞核中，轉染前與轉染HuR-siRNA248h相比，HuR熒光強度明顯減弱。
　　 3、RT-PCR實驗中，各泳道中β-actin

7、 mRNA條帶亮度相似，而轉染HuR-siRNA2表達質粒組條帶亮度明顯弱于空白對照組、脂質體對照組、HuR-siRNA-neg組條帶的亮度。空白對照組、脂質體對照組、HuR-siRNA-neg組、HuR-siRNA224h、48h、72h轉染組細胞中HuR mRNA的相對含量分別為：0.6082±0.01562、0.5965±0.02080、0.5699±0.01390、0.2650±0.01458、0.1801±0.01598、0.

8、0914±0.054723。轉染組24h、48h、72h組與以上三組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；HuR-siRNA-neg組與空白對照組、脂質體對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 4、Western-Blot實驗中，轉染HuR-siRNA2質粒24h組、48h組、72h組HuR蛋白相對灰度值分別為：0.5053±0.0233、0.2515±0.0155、0.1773±0.0104；HuR-siRNA-

9、neg組、空白對照組、脂質體轉染組相比無顯著性差異（P>0.05）。HuR-siRNA224h、48h、72h轉染組分別與以上三組相比均具有統(tǒng)計學意義（F=746.595，P<0.01）。HuR-siRNA224h組與空白對照組、HuR-siRNA-neg組、脂質體對照組相比具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HuR-siRNA248h、72h組與以上三個對照組相比差異具有顯著性（P<0.01）。轉染后72h組蛋白抑制率為73.76％。ER

10、-α在空白對照組、脂質體對照組、HuR-siRNA-neg組、HuR-siRNA224h、48h、72h轉染組細胞中與β-actin相對灰度比值分別為：0.6023±0.0277、0.5912±0.0277、0.5879±0.0277、0.5041±0.0072、0.4100±0.0140、0.2270±0.0189。HuR-siRNA2轉染24h與空白對照組、脂質體對照組、HuR-siRNA-neg組相比無統(tǒng)計學意義（P>0.05），

11、HuR-siRNA2轉染48h組與以上三個對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HuR-siRNA2轉染72h與以上三個對照組相比差異具有非常顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。HuR蛋白與ER-α蛋白在Ishikawa細胞表達經Spearman等級相關分析說明兩者之間存在明顯正相關關系（r=0.951，P=0.003）。
　　 5、通過MTT檢測法，HuR-siRNA2表達質粒轉染Ishikawa細胞后，細胞的增值速度隨著

12、轉染作用時間的延長明顯降低，在轉染72h增殖抑制最明顯，抑制率為34.26％，轉染24h組與空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）；轉染48h組、72h組與空白對照組比較差異有非常顯著性（P<0.01）；轉染96h組與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉染48h、72h組、96h組與HuR-siRNA-neg組比較差異有統(tǒng)計學意義（分別為P<0.05、P<0.01、P<0.05）；各轉染組對Ishikawa細胞抑制率分別為

13、15.31％、26.99％、34.26％、19.58％。
　　 6、通過流式細胞技術，與轉染的HuR-siRNA-neg組相比，HuR-siRNA2組細胞周期中G1期比例增加，G2/M期及S期細胞比例下降。HuR-siRNA-neg組與HuR-siRNA2組細胞凋亡比例分別為0.41％±0.49％、5.09％±1.58％。
　　 結論：
　　 HuR-siRNA2表達質粒對HuR基因表達有沉默作用，初步證實HuR