HuR siRNA對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道腫瘤發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，近年來由于女性壽命延長，高齡及肥胖女性增加，發(fā)病率逐年上升。長期以來對子宮內(nèi)膜癌的病因?qū)W研究一直是重點(diǎn)。但目前為止，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的確切機(jī)制仍不清楚。近來有關(guān)研究證實(shí)RNA結(jié)合蛋白（RNABPs）HuR在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展方面發(fā)揮重要作用。
　　 HuR，是胚胎致死異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家

2、族的一員，作為RNABPs，能通過結(jié)合并且穩(wěn)定在3’非翻譯區(qū)（UTR）中富含A，U（AREs）的片段，發(fā)揮其mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。編碼細(xì)胞因子、淋巴因子及原癌基因的一類早期反應(yīng)基因（ERGS）mRNA均含有AREs。以往的研究證實(shí)，HuR能在多種細(xì)胞系中表達(dá)，如：卵巢癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞系。子宮內(nèi)膜癌是一種雌激素依賴性腫瘤。雌激素受體有兩型，即ER-α和ER-β，它們同屬配體介導(dǎo)的核受體超家族成員。ER水平的改變可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、

3、轉(zhuǎn)錄后及表現(xiàn)遺傳學(xué)水平引起。ER-α的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合其AREs，編碼ER-α mRNA，從而調(diào)控ER-α有效的蛋白翻譯有關(guān)[1-3]。ER 3’UTR是一段4500的核苷酸片段，含有7個(gè)AREs，屬于AREs分類中的第1類，即在富含U區(qū)包含1.3個(gè)AUUUA拷貝[4]。但在目前的研究中，HuR在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及其對ER-α作用機(jī)制尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過細(xì)胞免疫熒光檢測HuR在Ishikaw

4、a子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的表達(dá)情況并運(yùn)過RNAi技術(shù)，將構(gòu)建的HuR siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Ishikawa細(xì)胞，探討HuR沉默后對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)特性及ER-α蛋白表達(dá)情況的影響，初步闡明HuR在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用以及與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系。
　　 方法：
　　 用細(xì)胞免疫熒光方法測定HuR在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系中的表達(dá)、轉(zhuǎn)染前后的變化；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的HuR siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入子宮內(nèi)膜

5、癌細(xì)胞。用RT-PCR和Western-Blot觀察轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中HuR mRNA、蛋白的表達(dá)及ER-α蛋白表達(dá)情況；以及應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及MTT比色法分別檢測轉(zhuǎn)染后子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞周期、凋亡及增殖的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、構(gòu)建HuR siRNAs并測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)相符；將設(shè)計(jì)的三條HuR-siRNA分別轉(zhuǎn)染入子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，HuR-siRNAl

6、、HuR-siRNA2、HuR-siRNA3對Ishikawa細(xì)胞中HuR mRNA表達(dá)抑制率分別為55.48％、82.81％、67.59％；故將構(gòu)建的HuR-siRNA2質(zhì)粒用作后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　 2、HuR免疫熒光結(jié)果顯示：HuR在Ishikawa細(xì)胞的胞核和胞漿中都有表達(dá)，但主要表達(dá)于胞核中，轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染HuR-siRNA248h相比，HuR熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　 3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，各泳道中β-actin

7、 mRNA條帶亮度相似，而轉(zhuǎn)染HuR-siRNA2表達(dá)質(zhì)粒組條帶亮度明顯弱于空白對照組、脂質(zhì)體對照組、HuR-siRNA-neg組條帶的亮度。空白對照組、脂質(zhì)體對照組、HuR-siRNA-neg組、HuR-siRNA224h、48h、72h轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中HuR mRNA的相對含量分別為：0.6082±0.01562、0.5965±0.02080、0.5699±0.01390、0.2650±0.01458、0.1801±0.01598、0.

8、0914±0.054723。轉(zhuǎn)染組24h、48h、72h組與以上三組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；HuR-siRNA-neg組與空白對照組、脂質(zhì)體對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 4、Western-Blot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染HuR-siRNA2質(zhì)粒24h組、48h組、72h組HuR蛋白相對灰度值分別為：0.5053±0.0233、0.2515±0.0155、0.1773±0.0104；HuR-siRNA-

9、neg組、空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組相比無顯著性差異（P>0.05）。HuR-siRNA224h、48h、72h轉(zhuǎn)染組分別與以上三組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=746.595，P<0.01）。HuR-siRNA224h組與空白對照組、HuR-siRNA-neg組、脂質(zhì)體對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HuR-siRNA248h、72h組與以上三個(gè)對照組相比差異具有顯著性（P<0.01）。轉(zhuǎn)染后72h組蛋白抑制率為73.76％。ER

10、-α在空白對照組、脂質(zhì)體對照組、HuR-siRNA-neg組、HuR-siRNA224h、48h、72h轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中與β-actin相對灰度比值分別為：0.6023±0.0277、0.5912±0.0277、0.5879±0.0277、0.5041±0.0072、0.4100±0.0140、0.2270±0.0189。HuR-siRNA2轉(zhuǎn)染24h與空白對照組、脂質(zhì)體對照組、HuR-siRNA-neg組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），

11、HuR-siRNA2轉(zhuǎn)染48h組與以上三個(gè)對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HuR-siRNA2轉(zhuǎn)染72h與以上三個(gè)對照組相比差異具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HuR蛋白與ER-α蛋白在Ishikawa細(xì)胞表達(dá)經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析說明兩者之間存在明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.951，P=0.003）。
　　 5、通過MTT檢測法，HuR-siRNA2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞的增值速度隨著

12、轉(zhuǎn)染作用時(shí)間的延長明顯降低，在轉(zhuǎn)染72h增殖抑制最明顯，抑制率為34.26％，轉(zhuǎn)染24h組與空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）；轉(zhuǎn)染48h組、72h組與空白對照組比較差異有非常顯著性（P<0.01）；轉(zhuǎn)染96h組與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h、72h組、96h組與HuR-siRNA-neg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P<0.05、P<0.01、P<0.05）；各轉(zhuǎn)染組對Ishikawa細(xì)胞抑制率分別為

13、15.31％、26.99％、34.26％、19.58％。
　　 6、通過流式細(xì)胞技術(shù)，與轉(zhuǎn)染的HuR-siRNA-neg組相比，HuR-siRNA2組細(xì)胞周期中G1期比例增加，G2/M期及S期細(xì)胞比例下降。HuR-siRNA-neg組與HuR-siRNA2組細(xì)胞凋亡比例分別為0.41％±0.49％、5.09％±1.58％。
　　 結(jié)論：
　　 HuR-siRNA2表達(dá)質(zhì)粒對HuR基因表達(dá)有沉默作用，初步證實(shí)HuR