siRNA靶向沉默PPARγ及PPARα對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡及侵襲力的影響.pdf

1、背景與目的:隨著對PPARs基因的深入了解，PPARγ在腫瘤中的作用日益成為學(xué)者們研究的焦點，有不少研究證明，其激動劑在體外研究中能夠促進腫瘤細胞的凋亡，但是在體內(nèi)研究和臨床研究中并不能取得相應(yīng)的效果，特別是在PPARγ表達陽性的腫瘤中效果不明顯。為此，本研究選擇PPARγ陽性表達的腫瘤細胞系KLE與HEC-1A細胞，利用RNA干擾技術(shù)，抑制PPARγ的表達，意在尋找治療PPARγ高表達腫瘤的一種更好的方法。 方法: （1

2、）PPARγ及α干擾RNA質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)Katherine L.Schaefer等人的實驗選擇干擾的靶點，依據(jù)選定的特異序列分別合成兩條DNA單鏈，退火后插入已酶切線性化的載體中，形成重組質(zhì)粒。采用通用型陰性對照序列同法構(gòu)建陰性對照載體。 （2）質(zhì)粒的擴增及鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行擴增，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用于酶切鑒定和測序。 （3）細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染KLE細胞與HEC-1A細胞常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程按照lipofect

3、amine2000說明書操作。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察，計數(shù)轉(zhuǎn)染效率。 （4）Western blotting檢測干擾RNA的沉默效率轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞，提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，目的條帶用AlphaEaseFC軟件分析系統(tǒng)進行灰度值分析。PPARγ條帶與actin條帶吸光度的比值表示蛋白表達量，干擾質(zhì)粒對細胞目的蛋白表達的抑制率為（1-轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細胞PPARγ蛋白表達的量/轉(zhuǎn)染空載

4、體表達的量）×100％。 （5）四唑鹽（MTT）比色試驗測定PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞KLE和HEC-1a細胞株生長的抑制作用分別設(shè)空白對照組、陰性質(zhì)粒組、重組干擾質(zhì)粒組，每組設(shè)6個復(fù)孔。以轉(zhuǎn)染后24、48、72、96小時為時間點，在酶標(biāo)檢測儀上測定各孔的吸光值，紀(jì)錄結(jié)果。抑制率=（1-處理組/空白對照組）×100％。 （6）Hoecht3222染色法檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞KLE和HEC-1a細胞株的

5、凋亡誘導(dǎo)作用轉(zhuǎn)染后72小時，Hoech3222染色，于熒光倒置顯微鏡下觀測胞核變化。分別取5個高倍鏡視野，計數(shù)凋亡變化的細胞個數(shù)所占比例為凋亡率，取平均值，并與陰性對照組細胞做比較。 （7）Transwell體外侵襲實驗檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞KLE和HEC-1a細胞株侵襲力的影響構(gòu)建體外侵襲試驗?zāi)Ｐ?，將轉(zhuǎn)染后24小時的細胞，種于transwell小室的上室，孵育24小時后觀察HE染色觀察侵襲的細胞數(shù)，計算侵襲率與對

6、照組細胞進行比較。 （8）四唑鹽（MTT）比色試驗檢測PPARa干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞的生長抑制作用方法參照“四唑鹽比色試驗檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞的生長抑制”。 （9）四唑鹽（MTT）比色試驗檢測PPARα干擾質(zhì)粒與PPARγ干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對子宮內(nèi)膜癌細胞生長的影響將轉(zhuǎn)染PPARγ干擾質(zhì)粒的KLE細胞、HEC-1a細胞行G418篩選后得到穩(wěn)定細胞株，分別以1.5×105/ml及5×105/ml密度接種于96

7、孔板，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒PPARα及陰性對照質(zhì)粒，空白對照組只加入無血清的培養(yǎng)基。具體方法參照“四唑鹽比色試驗檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞的生長抑制”。 （10）Hoecht3222染色法檢測PPARα干擾質(zhì)粒與PPARγ干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響將穩(wěn)篩后的KLE細胞、HEC-1a細胞以1.5×105/ml及5×105/ml密度接種于6孔板，CO2孵箱終培養(yǎng)，在37℃、5％CO2基飽和濕度條件下，培養(yǎng)

8、24h后轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒PPARα及陰性對照質(zhì)粒，空白對照組只加入無血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72小時Hoecht3222染色法檢測細胞凋亡。具體方法參照“Hoecht3222染色法檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜細胞凋亡的影響”。 結(jié)果: （1）轉(zhuǎn)染后24小時的轉(zhuǎn)染效率在兩種細胞種分別可到達69.8％±0.199，70.1％±0.077。 （2）轉(zhuǎn)染48小時后PPARγ干擾片段的沉默效率分別為62.9％±0.033，72.9

9、％±0.102； PPARα干擾片段的沉默效率分別為40.28％±0.0123，55.29％±0.02486。 （3）PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞株KLE及HEC-1a生長抑制作用呈時間依賴性。轉(zhuǎn)染后24小時，細胞生長抑制作用與對照組相比無明顯差異。轉(zhuǎn)染后48小時，出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的差別；72小時后，細胞生長出現(xiàn)明顯的抑制。 （4）PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞株KLE及HEC-1a細胞凋亡的影響PPARγ干擾質(zhì)粒

10、轉(zhuǎn)染細胞在60小時已出現(xiàn)早期核凋亡改變，核膜皺縮，成波浪狀，染色體凝集成塊狀。72小時，凋亡細胞明顯增多，KLE細胞干擾組與對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；HEC-1-A：干擾組與陰性對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。而空白對照組與陰性對照組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 （5）Transwell體外侵襲實驗檢測PPARγ干擾質(zhì)粒對子宮內(nèi)膜癌細胞KLE和HEC-1a細胞株侵襲力的降低。KLE、HEC-1-A細胞轉(zhuǎn)染48小時與空白對照組及陰性對

11、照組相比，干擾組的侵襲率明顯減少，KLE細胞：X2=93.32，v=1，P<0.05； HEC-1a細胞：X2=1.834，v=1，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 （6）PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KLE及HEC-1a細胞株后，生長抑制作用不明顯。轉(zhuǎn)染后72小時，對空白對照組、陰性對照組及干擾組的吸光度行方差分析， KLE細胞：F=2.198，P=0.123，P>0.05，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，而HEC-1a細胞對PPARα干擾質(zhì)粒的反應(yīng)

12、同樣無明顯差異。 （7）PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)篩后的KLE細胞株時，干擾組與空白對照組及陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義。而PPARα干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)篩的HEC-1a細胞株時，干擾組與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 （8）轉(zhuǎn)染PPARα干擾質(zhì)粒后72小時，穩(wěn)篩的KLE及HEC-1a的干擾組細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。穩(wěn)篩的KLE：干擾組與陰性對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；穩(wěn)篩的HEC-1a：干擾組與陰性對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；

13、 結(jié)論: 1.PPARγ的下調(diào)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞株KLE及HEC-1a的生長，此抑制作用呈時間依賴性。 2.PPARγ下調(diào)能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞株KLE及HEC-1a的凋亡 3.PPARγ的下調(diào)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞株KLE及HEC-1a侵襲的發(fā)生。 4.下調(diào)PPARα的表達，并沒有抑制腫瘤細胞生長或誘導(dǎo)凋亡，可能與選擇的干擾片斷效能有關(guān)，但同時下調(diào)PPARγ后，生長抑制作用明顯，說明PPARα及P