siRNA沉默uPAR和Cathepsin B基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　探討siRNA單獨(dú)或聯(lián)合沉默uPAR和Cathepsin B基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響。
　　方法:
　　用帶熒光的siRNA轉(zhuǎn)染人類(lèi)肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，篩選合適的siRNA轉(zhuǎn)染濃度，以該濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別人工構(gòu)建并合成靶向沉默uPAR和Cathepsin B基因的三條siRNA和一條陰性siRNA。轉(zhuǎn)染人類(lèi)肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和WB技術(shù)分別檢測(cè)基因水平

2、上和蛋白水平上沉默uPAR和Cathepsin B基因最好的siRNA，篩選出的兩個(gè)siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染后，熒光定量PCR技術(shù)和WB技術(shù)分別檢測(cè)uPAR和Cathepsin B的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單獨(dú)或聯(lián)合沉默uPAR和Cathepsin B基因后癌細(xì)胞的增殖情況?；|(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率的變化。
　　結(jié)果:
　　1.按Roch說(shuō)明書(shū)，從不

3、同比例的轉(zhuǎn)染試劑和siRNA中篩選出轉(zhuǎn)染最佳濃度，我們發(fā)現(xiàn)低濃度siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率達(dá)80％，細(xì)胞狀態(tài)最好。
　　2.按低濃度siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞SMMC-7721的uPAR和Cathepsin B基因水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后，與空白對(duì)照組(no-treatment control，NTC)相比，三個(gè)siRNA組的uPAR和Cathepsin B基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均受到明顯抑

4、制(P＜0.05)。由數(shù)據(jù)看出，在基因水平上，si-uPAR-C沉默uPAR基因效果最好，si-CTSB-B沉默Cathepsin B基因效果最好。
　　3.轉(zhuǎn)染后72h，WB法分別檢測(cè)各組uPAR和Cathepsin B的蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，三個(gè)siRNA組的uPAR和Cathepsin B蛋白的相對(duì)表達(dá)量受到明顯抑制(P＜0.05)。由數(shù)據(jù)看出，從蛋白水平上來(lái)說(shuō)，si-uPAR-C沉默uPAR的效果最好，si

5、-CTSB-B沉默Cathepsin B的效果最好。綜合基因和蛋白檢測(cè)的結(jié)果，uPAR基因選擇si-uPAR-C片段，Cathepsin B基因選擇si-CTSB-B片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　4.單獨(dú)或聯(lián)合沉默實(shí)驗(yàn)共設(shè)五組(NTC、LC、si-uPAR、si-CTSB、si-UC)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)單獨(dú)或聯(lián)合沉默后uPAR和Cathepsin B的基因水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后，與NTC組相比，uPAR基因在si-uPA

6、R和si-UC表達(dá)受到明顯抑制，CTSB基因在si-CTSB和si-UC表達(dá)受到明顯抑制，而且聯(lián)合沉默組比單獨(dú)沉默抑制效果更明顯(P＜0.05)。
　　5.WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染72h后，各組SMMC-7721細(xì)胞uPAR和Cathepsin B的蛋白水平。結(jié)果顯示，與NTC組相比，uPAR蛋白在si-uPAR和si-UC組表達(dá)受到明顯抑制，Cathespin B在si-CTSB和si-UC表達(dá)受到明顯抑制，聯(lián)合沉默組均比單獨(dú)沉默組抑制效果

7、更明顯(P＜0.05)。
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)合沉默后0h、24h、48h、72h細(xì)胞增殖情況。轉(zhuǎn)染24h后，si-CTSB組、si-UC組與NTC組相比細(xì)胞增殖明顯較少(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染48h后，si-uPAR組與NTC組相比細(xì)胞增殖明顯減少（P＜0.05），而且轉(zhuǎn)染48h后，聯(lián)合沉默組比單獨(dú)沉默組細(xì)胞增殖抑制更明顯(P＜0.05)。NTC組與LC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　7.侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染后后

8、48h，與空白對(duì)照組間比較，各siRNA組侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，聯(lián)合沉默組比單獨(dú)沉默組減少更明顯（P＜0.05）
　　8.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡，轉(zhuǎn)染后48h，單獨(dú)或聯(lián)合沉默組中凋亡細(xì)胞比NTC組明顯增多(P＜0.05)，聯(lián)合沉默組凋亡細(xì)胞較單獨(dú)沉默組明顯增多(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　siRNA靶向沉默uPAR或Cathepsin B基因能有效減少該基因的表達(dá)。單獨(dú)沉默或聯(lián)合沉默uPAR或C