TIMP-3基因對肝癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉移的影響.pdf

1、目的：
　　建立以真核表達載體介導的過表達 TIMP-3基因的肝癌細胞株（SMMC-7721和HepG2），研究TIMP-3基因對兩肝癌細胞增殖、凋亡、生長周期、侵襲、遷移等細胞生物學功能的影響。
　　方法：
　　1.研究質粒 pCMV6-AC-GFP/TIMP-3（TIMP-3）和陰性對照質粒pCMV6-AC-GFP（NC）的擴增和鑒定：把 TIMP-3質粒和NC質粒稀釋后轉化入大腸桿菌中擴增，測序鑒定后提取純凈無內

2、毒素的TIMP-3質粒和NC質粒，用于后續(xù)實驗。
　　2.用擴增后的TIMP-3質粒和NC質粒分別轉染兩肝癌細胞株，因用800μg/ml G418連續(xù)篩選2周后，NC組細胞均死亡，故降低G418濃度至400μg/ml繼續(xù)篩選2周，成功構建陽性單細胞克隆，用Western Blot技術檢測細胞中TIMP-3蛋白表達。
　　3.利用MTS增殖實驗繪制細胞生長曲線，檢測TIMP-3基因穩(wěn)定表達后肝癌細胞的生長情況。
　　4.

3、利用流式細胞儀檢測TIMP-3基因穩(wěn)定表達后的肝癌細胞凋亡和細胞周期變化情況。
　　5.利用Transwell小室細胞侵襲實驗和遷移實驗檢測TIMP-3基因穩(wěn)定表達后的肝癌細胞侵襲能力和遷移能力變化。
　　結果：
　　1.TIMP-3質粒和NC質粒成功轉至大腸桿菌中，與原始序列進行比對，結果完全一致，可用于后續(xù)實驗。
　　2.利用非脂質體轉染試劑把TIMP-3質粒和NC質粒分別轉染兩肝癌細胞株，得到穩(wěn)定高表達 T

4、IMP-3的單克隆陽性細胞株。命名為 TIMP-3組 SMMC-7721及HepG2細胞，而穩(wěn)定轉染空載的細胞命名為空白對照組SMMC-7721及HepG2細胞。經Western blot證實TIMP-3組細胞表達TIMP-3蛋白，而NC組細胞則沒有TIMP-3蛋白表達。
　　3.MTS實驗檢測顯示TIMP-3組SMMC-7721及HepG2細胞增殖力顯著弱于NC組（P<0.05）。
　　4.流式細胞術顯示 TIMP-3誘導

5、兩肝癌細胞發(fā)生凋亡(SMMC-7721：30.7±1.6％vs8.4±1.1%，P=0.001；HepG2：12.6±1.1%vs7.6±1.3%，P=0.038）和產生G2/M期阻滯[SMMC-7721：（G0/G1期：(36.075±3.53)%vs(57.72±1.53)%， G2/M期：(51.91±1.71)%vs(30.11±0.20)%，P=0.030）；HepG2：（G0/G1期：(49.82±1.46)%vs(59.4

6、7±1.27)%，G2/M期：(26.27±0.54)%vs(14.15±3.6)%，P=0.034）]。
　　5.體外侵襲實驗顯示TIMP-3使兩肝癌細胞的侵襲能力顯著降低（SMMC-7721：60±11 vs121±17，P=0.033；HepG2：98±6 vs192±22，P=0.015）；體外遷移實驗顯示TIMP-3使兩肝癌細胞的遷移能力顯著降低（SMMC-7721：53±8 vs102±10，P=0.038；HepG2