SEPT9基因過表達對人肝癌HepG2細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建SEPT9基因真核表達載體轉(zhuǎn)染惰性轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株HepG2，研究SEPT9基因過表達對HepG2細胞增殖、遷移以及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，探討SEPT9在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為SEPT9成為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移新的生物學指標及基因治療靶點提供更充分的依據(jù)。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞，待細胞生長狀態(tài)良好并達到指數(shù)生長期時接種于6孔板，接種后24h內(nèi)將SEPT9基因真核表達載體pIRES2/EGFP-SEPT9轉(zhuǎn)染He

2、pG2細胞。設(shè)過表達組（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2/EGFP-SEPT9）、空質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES2/EGFP）和空白組（不加任何特殊試劑正常培養(yǎng)）。各孔HepG2細胞中加入脂質(zhì)體LipofectamineTM200010μl+DNA4μg混合物進行轉(zhuǎn)染。①轉(zhuǎn)染后48h，熒光顯微鏡下觀察帶有EGFP的細胞所占比例，判斷轉(zhuǎn)染效率。②轉(zhuǎn)染后72h，細胞裂解法提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，脫

3、脂奶粉封閉，一抗、二抗雜交孵育，化學發(fā)光液顯影，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)自動曝光，凝膠成像儀掃描Image J2X軟件分析，檢測各組細胞中SEPT9蛋白相對于內(nèi)參蛋白GAPDH的表達量。③以轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h為時間點，CCK-8法檢測SEPT9基因過表達對細胞生長增殖的影響。④轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h細胞劃痕實驗檢測各組HepG2細胞遷移運動能力變化。⑤轉(zhuǎn)染后48h Transwell實驗檢測各組HepG2細胞侵襲

4、性及轉(zhuǎn)移性。
　　結(jié)果:①轉(zhuǎn)染后48h，綠色熒光細胞所占比率判斷出轉(zhuǎn)染效率約達70％。②western blot法分析顯示:過表達組SEPT9蛋白條帶亮度明顯強于兩對照組。定量分析顯示，空白組、空質(zhì)粒組、過表達組SEPT9蛋白的相對表達量分別為0.7078±0.018、0.7136±0.012、1.0526±0.020。經(jīng)SNK-q檢驗方差分析，過表達組SEPT9蛋白相對表達量分別與兩對照組相比，約上升了48％左右，差異有統(tǒng)計學意

5、義(P＜0.05)。③CCK-8法結(jié)果顯示:與兩對照組比較，過表達組HepG2細胞在轉(zhuǎn)染后24～72h內(nèi)增殖速度增快，48h達到21.726％，72h達到30.164％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。④細胞劃痕實驗結(jié)果，24～72h過表達組劃痕寬度變化快，相比兩對照組，劃痕出現(xiàn)了明顯愈合趨勢。軟件測量并計算各時間段遷移距離，過表達組細胞遷移距離與兩對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。⑤侵襲實驗和遷移實驗結(jié)果均顯示過表達組穿