HDGF和ADAM9對肝癌HepG2細(xì)胞增殖侵襲能力的影響及其相互調(diào)控關(guān)系研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)是較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤的第五位，死亡率極高，在惡性腫瘤死亡率排名中居第三位，僅次于胃癌、食道癌。我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死亡人數(shù)約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％左右。導(dǎo)致肝癌發(fā)病的因素包括病毒性肝炎、肝硬化、真菌及黃曲霉素、遺傳因素等，這些致癌因素通過促發(fā)癌基因的過度表達(dá)、抑癌基因丟失或突變，最終引發(fā)肝癌的發(fā)生。肝癌衍生生長因子(hep

2、atoma-derived growth factor，HDGF)是最早從人肝癌細(xì)胞系HuH-7的條件培養(yǎng)基中分離得到的一種酸性肝素結(jié)合蛋白，是一種陽離子多肽，其結(jié)構(gòu)與bFGF相關(guān)，基因分子量為18.5～19.5KD。目前研究表明，HDGF在許多正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，而在肝癌、肺癌和胃癌等惡性腫瘤中顯著高表達(dá)，腫瘤的惡性程度越高，HDGF的表達(dá)強(qiáng)度也越高，因此HDGF有望成為一種新的預(yù)測肝癌及其它惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志

3、物和治療靶點。
　　本研究的目標(biāo)是首先探討HDGF與ADAM9在肝癌、癌旁組織及正常對照肝組織中的表達(dá)情況，了解其表達(dá)相互關(guān)系。然后采用siRNA方法抑制HDGF及ADAM9基因的表達(dá)，研究HDGF在HepG2肝癌細(xì)胞中的作用和對ADAM9的表達(dá)影響，最后檢測下調(diào)表達(dá)HDGF和ADAM9后HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并一步探討HDGF與ADAM9在肝癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中可能發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　本研究

4、收集了32名肝癌患者的腫瘤組織與其癌旁組織標(biāo)本，以及14例肝血管瘤患者的肝組織，利用Trizol方法提取總RNA。此外，利用同樣的方法提取了HepG2細(xì)胞的總RNA。隨后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實時熒光定量PCR方法檢測了HDGF和ADAM9在肝癌、癌旁、正常肝組織及HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況。隨后應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測了其在蛋白水平的表達(dá)情況。進(jìn)一步實驗中，利用Invitrogen公司在線網(wǎng)站設(shè)計了分別針對HD

5、GF和ADAM9基因的特異shRNA片段，然后將其各自構(gòu)建到pGPU6/GFP/NEO表達(dá)載體上，測序確定序列是否完全正確。隨后，利用Lipofectamin2000將二者分別轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，利用G418進(jìn)行陽性克隆細(xì)胞篩選，14天后，在培養(yǎng)板中出現(xiàn)了單克隆細(xì)胞。隨后對這些細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取這些細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞中HDGF和ADAM9的基因表達(dá)以確定干擾效率。Western

6、blot確證干擾HDGF和ADAM9基因后蛋白表達(dá)水平。隨后，利用MTT法檢測HDGF和ADAM9基因下調(diào)表達(dá)后細(xì)胞增殖情況;最后，利用Transwell小室檢測HDGF和ADAM9基因被干擾下調(diào)后細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果：
　　利用常規(guī)的TrizoI方法，成功的提取了肝癌、癌旁、正常肝組織及HepG2細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，肝癌組織及HepG2細(xì)胞中，HDGF和ADAM9基因的m

7、RNA表達(dá)量都明顯高于癌旁組織。Western blot檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR結(jié)果一致。接下來，本研究構(gòu)建了特異性靶向抑制HDGF和ADAM9基因的表達(dá)載體——pGPU6/GFP/NEO-HDGF和pGPU6/GFP/NEO-ADAM9，序列分析表明完全正確。隨后轉(zhuǎn)染表達(dá)載體至HepG2細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)shRNA-HDGF和shRNA-ADAM9的細(xì)胞株。實時熒光定量PCR檢測單克隆細(xì)胞株HepG2-shRNA-HDGF的HD

8、GF mRNA表達(dá)抑制效率為93％;單克隆細(xì)胞株HepG2-shRNA-ADAM9的ADAM9 mRNA表達(dá)抑制效率為90％。HepG2-shRNA-HDGF細(xì)胞株的ADAM9基因表達(dá)量也受到抑制，抑制效率達(dá)88％，而HepG2-shRNA-ADAM9細(xì)胞株中HDGF的表達(dá)變化不明顯。Westernblot分析HDGF和ADAM9蛋白表達(dá)水平，與定量PCR結(jié)果相符。用MTT方法分析細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，HepG2-shRNA-HDGF和He

9、pG2-shRNA-ADAM9的生長曲線明顯低于對照組shRNA-Control和未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞;細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)HepG2-shRNA-HDGF和HepG2-shRNA-ADAM9侵襲能力也明顯低于對照組shRNA-Ctr和未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　HDGF和ADAM9于肝癌組織和HepG2細(xì)胞中高表達(dá)。特異性靶向干擾HDGF和ADAM9基因表達(dá)在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致了HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲