人Canstatin基因轉(zhuǎn)染對肝癌HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響及機制研究.pdf

1、目的：通過肝癌HepG2細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，觀察其形成血管生成擬態(tài)的能力，探討重組人Canstatin基因表達(dá)產(chǎn)物對肝癌HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成能力的影響及作用機制。
　　 方法：將pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重組質(zhì)粒，用Cacl2法轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5a，經(jīng)AMP篩選，挑取陽性質(zhì)粒酶切鑒定、測序，用脂質(zhì)載體介導(dǎo)法將pcDNA3.1-Canstatin-3Flag轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，以空載體

2、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染肝癌HclpG2細(xì)胞為對照，經(jīng)G418培養(yǎng)基篩選獲得陽性克隆，Western-blot鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Canstatin蛋白的表達(dá)。建立HepG2細(xì)胞基底膜基質(zhì)凝膠體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，以HepG2細(xì)胞在六孔板中常規(guī)培養(yǎng)為對照，觀察HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成能力。各組細(xì)胞(HepG2細(xì)胞組、空載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組、重組載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組)分別在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)48h，MTT法檢測各組增殖抑制率。各組細(xì)胞

3、在基底膜基質(zhì)凝膠進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，觀察比較各組細(xì)胞的血管生成擬態(tài)形成能力，同時用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞MMp-2、VE-cadherin蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功獲得684bp人Canstatin基因，測序證明與Genbank中比對一致。PCR可檢測出重組載體轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞基因組中存在Canstatin基因，Western-blot可檢測出Canstatin基因在重組載體轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞中有特異性表達(dá)。人肝癌

4、HepG2細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)72h，直接在倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞呈長梭形，周邊長出多個偽足，彼此之間形成網(wǎng)狀連接，形成環(huán)狀或管狀結(jié)構(gòu)(血管生成擬態(tài)VM)，而人肝癌HepG2細(xì)胞在六孔板中常規(guī)培養(yǎng)下貼壁生長，未見VM結(jié)構(gòu)。MTT法檢測HepG2細(xì)胞組、空載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組、重組載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組490nm波長吸光度值并計算增殖抑制率分別為：0％、3.57％、14.80％。倒置顯微鏡下(×200)隨機取上、下、左、右、中5個

5、視野記錄環(huán)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量，重組載體轉(zhuǎn)染組VM結(jié)構(gòu)的計數(shù)為(2.67±2.08)個，低于HepG2細(xì)胞組(9.67±3.51)個(P<0.01)，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(11.00±3.61)個對比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與HepG2細(xì)胞組對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞VE-canherin蛋白表達(dá)灰度值為：重組載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(5.63±0.42)，低于空載體轉(zhuǎn)染組(14.58±0.72)(P<0.0

6、1)，同時也低于HepG2細(xì)胞組(16.73±1.32)(P<0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組和HepG2細(xì)胞組VE-cadherin蛋白表達(dá)灰度值無差異(P>0.01)。HepG2組、空載體轉(zhuǎn)染HepG2組、重組載體轉(zhuǎn)染HepG2組MMp-2蛋白表達(dá)灰度值分別為27.53±1.03、25.72±0.83、27.02±2.13，各組間P值無顯著性差異(P>0.01)。
　　 結(jié)論：1.人肝癌HepG2細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)下未見VM結(jié)構(gòu)，

7、在體外三維培養(yǎng)條件下具有血管生成擬態(tài)的形成能力；2.成功將pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人HepG2細(xì)胞中，細(xì)胞中有Canstatin蛋白表達(dá)；3.Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖；4.Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成能力；5.Canstatin蛋白可抑制體外三維培養(yǎng)條件下HepG2細(xì)胞VE-cadherin蛋白的表達(dá)，對MMp2的表達(dá)沒有影響