人canstatin基因轉(zhuǎn)染及其對(duì)體外培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及遷移的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建含有canstatin基因的分泌型表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，觀察表達(dá)產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞遷移能力和調(diào)亡的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為三部分。第一部分為含有canstatin重組質(zhì)粒的構(gòu)建，包括：1.Canstatin基因從胎盤(pán)組織中獲取，RT-PCR擴(kuò)增Canstatin cDNA及切膠回收并純化，酶切pcDNA3.1(-)-3flag載體質(zhì)粒后，采用DNA定向連接技術(shù)構(gòu)建含有canstatin的重組質(zhì)粒

2、pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin；2-pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α；3.重組質(zhì)粒的擴(kuò)增及提取質(zhì)粒DNA；4.質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切鑒定及篩選后陽(yáng)性質(zhì)粒制成甘油菌送往公司測(cè)序；第二部分為pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞及mRNA和蛋白水平表達(dá)的鑒定，包括：1.脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，G418篩選

3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌HepG2細(xì)胞；2.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)并比較canstatin在穩(wěn)轉(zhuǎn)后的肝癌HepG2細(xì)胞的表達(dá)；3.Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細(xì)胞的上清液中canstatin蛋白的表達(dá)；4.收集含有canstatin的重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的肝癌HepG2細(xì)胞的上清液；第三部分為cantatin蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和遷移能力的影響的檢測(cè)，包括：1.實(shí)驗(yàn)分組：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的上清液組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表

4、達(dá)的上清液組，穩(wěn)轉(zhuǎn)后肝癌HepG2細(xì)胞組，未轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)；2.各組作用于培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞；3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞、凋亡率；4.Trance wel l小室和劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)重組基底膜的遷移能力。
　　 結(jié)果：1.于胎盤(pán)組織獲得684bp人canstatin基因，測(cè)序證明canstatin cDNA編碼序列與基因庫(kù)中登錄的中國(guó)人canstatin序列比較，符合率百分之百。構(gòu)建的分泌型真核

5、表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin經(jīng)酶切可得到5000bp和700bp兩個(gè)條帶，與pcDNA3.1(-)-3flag載體質(zhì)粒5400bp和canstatin684bp相符合。2.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞并用400μg/mlG418濃度篩選得到可以穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，RT-PCR證實(shí)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/can

6、statin已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后基因拷貝數(shù)為842128，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液和上清液，在SDS-PAGE凝膠上均得到一條約26KD的新蛋白，與canstatin蛋白大小相接近。3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液作用的肝癌HepG2細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細(xì)胞組的凋亡率(分別為15.50±0.77和13.33±0.92)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液作用組和正常培養(yǎng)的未

7、轉(zhuǎn)染組的凋亡率(分別為0.48±0.05和0.35±0.09)p<0.01，并且重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液作用組的凋亡率也高于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細(xì)胞組的凋亡率(p<0.01)；而以上各組細(xì)胞24h和48h的遷移率之間都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功購(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin；
　　 2.pcDNA3.1-Canstatin-3Flag