人canstatin基因轉(zhuǎn)染及其對體外培養(yǎng)肝癌HepG2細胞凋亡及遷移的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建含有canstatin基因的分泌型表達重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，觀察表達產(chǎn)物對體外培養(yǎng)肝癌細胞遷移能力和調(diào)亡的影響。
　　 方法：實驗分為三部分。第一部分為含有canstatin重組質(zhì)粒的構(gòu)建，包括：1.Canstatin基因從胎盤組織中獲取，RT-PCR擴增Canstatin cDNA及切膠回收并純化，酶切pcDNA3.1(-)-3flag載體質(zhì)粒后，采用DNA定向連接技術構(gòu)建含有canstatin的重組質(zhì)粒

2、pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin；2-pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α；3.重組質(zhì)粒的擴增及提取質(zhì)粒DNA；4.質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切鑒定及篩選后陽性質(zhì)粒制成甘油菌送往公司測序；第二部分為pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細胞及mRNA和蛋白水平表達的鑒定，包括：1.脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，G418篩選

3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌HepG2細胞；2.實時定量PCR檢測并比較canstatin在穩(wěn)轉(zhuǎn)后的肝癌HepG2細胞的表達；3.Western blot檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細胞的上清液中canstatin蛋白的表達；4.收集含有canstatin的重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的肝癌HepG2細胞的上清液；第三部分為cantatin蛋白對體外培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞凋亡和遷移能力的影響的檢測，包括：1.實驗分組：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的上清液組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表

4、達的上清液組，穩(wěn)轉(zhuǎn)后肝癌HepG2細胞組，未轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞組(空白對照組)；2.各組作用于培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞；3.流式細胞儀檢測凋亡細胞、凋亡率；4.Trance wel l小室和劃痕實驗測定轉(zhuǎn)染細胞對重組基底膜的遷移能力。
　　 結(jié)果：1.于胎盤組織獲得684bp人canstatin基因，測序證明canstatin cDNA編碼序列與基因庫中登錄的中國人canstatin序列比較，符合率百分之百。構(gòu)建的分泌型真核

5、表達載體pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin經(jīng)酶切可得到5000bp和700bp兩個條帶，與pcDNA3.1(-)-3flag載體質(zhì)粒5400bp和canstatin684bp相符合。2.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞并用400μg/mlG418濃度篩選得到可以穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，RT-PCR證實質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/can

6、statin已成功轉(zhuǎn)染進入肝癌HepG2細胞，實時定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后基因拷貝數(shù)為842128，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液和上清液，在SDS-PAGE凝膠上均得到一條約26KD的新蛋白，與canstatin蛋白大小相接近。3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞上清液作用的肝癌HepG2細胞組和轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細胞組的凋亡率(分別為15.50±0.77和13.33±0.92)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞上清液作用組和正常培養(yǎng)的未

7、轉(zhuǎn)染組的凋亡率(分別為0.48±0.05和0.35±0.09)p<0.01，并且重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞上清液作用組的凋亡率也高于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細胞組的凋亡率(p<0.01)；而以上各組細胞24h和48h的遷移率之間都沒有統(tǒng)計學的差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功購建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-3flag/canstatin；
　　 2.pcDNA3.1-Canstatin-3Flag