V-ATPase抑制劑對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞行為的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：本研究以人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)探討V-ATPase抑制劑(PI-230)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡的影響，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期、線粒體膜電位和cleaved-caspase-3的檢測(cè)初步探討抗癌的可能機(jī)制；同時(shí)以正常肝細(xì)胞株LO2為對(duì)照，評(píng)價(jià)(PI-230)的毒性作用。本研究意在為以腫瘤細(xì)胞pH調(diào)節(jié)機(jī)制為靶點(diǎn)的抗癌策略提供新的證據(jù)，為(PI-230)抗癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 方法：選擇肝細(xì)胞癌細(xì)胞株

2、HepG2和人正常肝臟細(xì)胞株LO2，分別進(jìn)行細(xì)胞同步化處理后，用細(xì)MTT法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞存活率分析儀對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)法來(lái)檢測(cè)PI-230對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，且用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞DNA周期。運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)AnnexinⅤ-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率和Tunel法測(cè)晚期細(xì)胞凋亡率，用Western-Blot技術(shù)測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)和用流式細(xì)胞儀測(cè)線粒體膜電位電位。
　　 結(jié)果：①相對(duì)對(duì)照組，PI-230

3、作用24h后分別對(duì)HepG2和LO2細(xì)胞80μM組存活率沒(méi)有明顯影響(均p>0.05)，而對(duì)160μM、320μM和640μM組存活率均降低，(均p<0.05)，且隨濃度的增加存活率降低。②與對(duì)照組相比，PI-230作用14天后對(duì)HepG2細(xì)胞10μM、20μM、40μM、80μM和120μM組集落形成數(shù)和形成率均減少(均p<0.05)，且隨濃度增加集落形成數(shù)下降，120μM組基本沒(méi)有集落形成；對(duì)LO2細(xì)胞10μM和20μM組集落形成數(shù)

4、均沒(méi)有顯著影響(p>0.05)，而對(duì)40μM、80μM和120μM組集落形成減少(均P<0.05)，且隨濃度增加集落形成數(shù)下降，120μM組基本沒(méi)有集落形成。③PI-230分別作用1天、2天、3天、4天、5天和7天后，與對(duì)照組相比，對(duì)HepG2細(xì)胞作用1天、2天、3天、4天、5天和7天后，對(duì)40μM、80μM和120μM組細(xì)胞數(shù)均有明顯影響(均p<0.05)，且隨時(shí)間和濃度增加，差異越顯著，且對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間有影響即隨濃度增加倍增時(shí)間呈遞

5、增關(guān)系，而對(duì)LO2細(xì)胞40μM組細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著差異(p<0.05)，而對(duì)80μM和120μM組均有顯著影響(均p<0.05)，即細(xì)胞數(shù)隨濃度增加顯著降低，且隨時(shí)間增加影響越來(lái)越顯著，同時(shí)對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間有影響即隨濃度增加倍增時(shí)間呈遞增關(guān)系。④PI-230作用48h后，相對(duì)對(duì)照組對(duì)人肝癌細(xì)胞40μM組細(xì)胞抑制率沒(méi)有明顯差異(p>0.05)，而80、120、160和200μM組均有明顯差異(均p<0.05)，且隨劑量增加而增大；對(duì)LO2，相對(duì)

6、正常對(duì)照組，40、80μM組均無(wú)明顯差異，而對(duì)120μM、160μM、200μM組均有顯著差異(均p<0.05)。⑤PI-230作用48h后，對(duì)HepG2細(xì)胞相對(duì)對(duì)照組，120μM、160μM和200μM組處于G0/G1期細(xì)胞百分比和PI值均明顯增加(均p<0.05)，而對(duì)LO2細(xì)胞均沒(méi)有明顯改變(p>0.05)。⑥PI-230作用24h后，與對(duì)照組相比，對(duì)HepG2細(xì)胞80μM組其早期凋亡率沒(méi)有明顯影響(p>0.05)，而對(duì)120μM

7、、160μM和200μM組均有明顯影響(均p<0.05)，但與藥物濃度沒(méi)有明顯的劑量關(guān)系；對(duì)LO2細(xì)胞80μM、120μM和160μM組沒(méi)有明顯影響(均p>0.05)，而對(duì)200μM組有明顯影響，存在顯著差異(p<0.05)。⑦與對(duì)照組相比，PI-230作用48h后，對(duì)HepG2細(xì)胞晚期凋亡率有影響，使120μM、160μM和200μM組凋亡率增加。⑧PI-230作用48h后，分別測(cè)得HepG2細(xì)胞200μM組cleaved caspa

8、se-3蛋白表達(dá)相對(duì)對(duì)照組增加(p<0.05)，而LO2細(xì)胞200μM組處理cleaved caspase-3蛋白表達(dá)未顯著增加(p>0.05)。⑨與正常組相比，PI-230作用48h后，對(duì)HepG2和LO2細(xì)胞160μM和200μM組線高粒體電位膜電位和低線粒體膜電位均存在顯著差異(均p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)V-ATPase抑制劑(PI-230)具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，作抗癌藥開(kāi)發(fā)具有潛在的價(jià)值。(